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Abstract

Hepatitis E virus (HEV) is a major cause of acute viral hepatitis worldwide. While genotype 1 (HEV 1) and HEV-2 exclusively result in acute infections, HEV-3 and HEV-4 infections are at a high risk of becoming chronic in immunocompromised individuals. HEV is a single-stranded RNA virus encoding three viral proteins: the viral replicase, ORF1, the capsid protein, ORF2, and ORF3, a protein essential for virion release. In hepatocytes, HEV induces a cell-intrinsic antiviral response through the expression of type III interferons (IFNs) and IFN-stimulated genes (ISGs). HEV replication can persist despite this sustained antiviral signaling, suggesting the presence of immune evasion strategies. Even though all viral proteins have been proposed to antagonize antiviral and inflammatory signaling pathways, their contributions to persistent HEV replication remain unclear. To identify the determinants of HEV persistence, I aimed to perform a comprehensive characterization of the HEV-induced cell-intrinsic antiviral response across different hepatocellular systems, in bulk and at the single-cell level.

First, I evaluated the integrity of the relevant antiviral and inflammatory signaling pathways in the hepatoma cell line HepG2/C3A and pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells (HLCs). I further sought to identify the pattern recognition receptors (PRRs) specifically contributing to HEV sensing. Then, I aimed to assess the viral antagonisms mediated by the HEV proteins ORF2 and ORF3. In a comprehensive side-by-side comparison, I found that ORF2 from HEV-3 and HEV-1, rather than ORF3, interferes with antiviral and inflammatory signaling downstream of PRRs. By co-immunoprecipitation, I demonstrated that ORF2 directly interacts with TANK binding kinase 1 (TBK1), a central hub of antiviral signaling, through an unidentified interaction motif. To clarify the impact of the ORF2-mediated antagonism in the context of full-length HEV infection, I exploited HEV 3 mutants lacking expression of ORF2 (ΔORF2) or ORF3 (ΔORF3). Electroporation with ΔORF2 RNA and infection with trans-complemented ΔORF2 virus particles in HepG2/C3A cells and HLCs resulted in significantly impaired viral replication. This was a direct consequence of the increased expression of antiviral response genes due to the absent TBK1 inhibition, which is mediated by intracellular ORF2. Using spatial RNA fluorescence in situ hybridization and single-cell RNA-sequencing, I demonstrated that both actively infected cells and uninfected bystanders are the sources of the ISG response in HEV infection. In both cell types, a similar ISG subset was induced, which was globally enhanced in the absence of the ORF2 protein. These findings emphasized the persistence of HEV replication in a directly antiviral environment. Moreover, I observed that ΔORF2 replication is more vulnerable to the effectors of the antiviral response, revealing an additional and hitherto unrecognized, protective function of ORF2. Using a synchronized infection approach, I found that ORF2 drives the establishment of a balance between HEV replication and the antiviral response, following a replication-limiting bottleneck early in infection. I concluded that the various identified strategies of antiviral immune evasion mediated by ORF2 are essential for enabling persistent HEV replication in the presence of a sustained yet dampened IFN and ISG response.

The results obtained during the course of my PhD, which are presented in this dissertation, contribute to elucidating the multifaceted functions of the capsid protein ORF2 within the HEV life cycle. They further identify the antiviral immune evasion strategies mediated by ORF2 as central determinants for persistent HEV replication in hepatocytes. My findings thus provide a foundation for exploring the crosstalk between HEV-infected hepatocytes and professional immune cells in the future, and for the investigation of intergenotypic differences in the antiviral response. Ultimately, these studies will provide novel insights into decisive factors for the pathogenesis of acute and chronic manifestations of HEV infection.

Translation of abstract (German)

Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist weltweit eine der Hauptursachen für akute virale Hepatitis. Während Genotyp 1 (HEV-1) und HEV-2 ausschließlich akute Infektionen hervorrufen, können Infektionen mit HEV-3 und HEV-4 insbesondere bei immungeschwächten Individuen mit einem hohen Risiko zu chronischen Verläufen führen. HEV ist ein einzelsträngiges RNA-Virus, das für drei virale Proteine kodiert: die viral Replikase ORF1, das Kapsidprotein ORF2, und ORF3, welches für die Freisetzung neuer Virionen essenziell ist. In Hepatozyten verursacht HEV eine zellintrinsische antivirale Antwort, die sich durch die Expression von Typ-III-Interferon und Interferon-stimulierten Genen auszeichnet. Die HEV-Replikation persistiert trotz dieser bestehenden antiviralen Antwort, was auf das Vorhandensein von Mechanismen zur Immunevasion hindeutet. Laut bisheriger Studien haben alle HEV-Proteine das Potenzial, die antivirale Immunantwort zu inhibieren. Die genaue Relevanz dieser Mechanismen für die HEV-Replikation ist jedoch noch nicht geklärt. Mit dem Ziel, zentrale Faktoren der HEV-Persistenz zu identifizieren, habe ich die durch HEV induzierte antivirale Immunantwort in verschiedenen hepatozellulären Modellsystemen umfassend charakterisiert – sowohl auf der Ebene der Gesamtzellpopulation als auch auf der Einzelzellebene.

Zunächst evaluierte ich die Vollständigkeit und Funktionalität der relevanten antiviralen und inflammatorischen Signalwege in der Hepatomzelllinie HepG2/C3A und in hepatozytenähnlichen Zellen (hepatocyte-like cells, HLCs), die ich aus pluripotenten Stammzellen differenziert hatte. Darüber hinaus versuchte ich, die Mustererkennungs-rezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs) zu identifizieren, die zur HEV-Erkennung durch die antivirale Antwort beitragen. Anschließend war es mein Ziel, die Inhibitionsstrategien der viralen Proteine ORF2 und ORF3 zu charakterisieren. In einem umfassenden, direkten Vergleich kam ich zu dem Ergebnis, dass das ORF2-Protein von HEV-1 und HEV-3 – nicht jedoch das ORF3-Protein – mit antiviralen und inflammatorischen Signalwegen, ausgehend von den PRRs, interferiert. Mittels Co-Immunpräzipitation konnte ich zeigen, dass ORF2 direkt mit der TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1), einer zentralen Komponente der antiviralen Antwort, interagiert. Die Bindestelle des ORF2-Proteins konnte jedoch nicht identifiziert werden. Um den Einfluss der TBK1-Inhibition durch ORF2 auf die HEV-Infektion zu analysieren, nutzte ich HEV-3-Mutanten, die entweder das ORF2-Protein (ΔORF2) oder das ORF3-Protein (ΔORF3) nicht exprimierten. Mittels Elektroporation der ΔORF2-Mutante oder durch Infektion mit transkomplementierten ΔORF2-Virionen in HepG2/C3A-Zellen oder HLCs stellte ich eine verringerte virale Replikation fest. Ursache dieses Phänotyps war eine verstärkte Expression von Genen der antiviralen Antwort aufgrund der fehlenden TBK1-Inhibition durch das intrazelluläre ORF2-Protein. Mithilfe von RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung stellte ich fest, dass die antivirale Antwort sowohl von aktiv infizierten Zellen als auch von umgebenden, uninfizierten Zellen, den sogenannten Bystander-Zellen, ausgelöst wird. In beiden Zelltypen wurde die Expression ähnlicher antiviraler Gene induziert, jedoch deutlich stärker in Abwesenheit des ORF2-Proteins. Diese Erkenntnisse wiesen verstärkt darauf hin, dass die HEV-Replikation inmitten einer antiviralen Umgebung persistiert. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Replikation der ΔORF2-Mutante empfindlicher gegenüber den Effektormolekülen der antiviralen Antwort ist, was auf eine zusätzliche, bislang unbekannte protektive Funktion des ORF2-Proteins hinweist. Mithilfe eines synchronisierten Infektionsexperiments konnte ich zeigen, dass das ORF2-Protein eine zentrale Rolle bei der Etablierung eines Gleichgewichts zwischen viraler Replikation und antiviraler Antwort spielt, das infolge eines replikationslimitierenden Engpasses früh in der Infektion entsteht. Ich schlussfolgerte, dass die von mir identifizierten Strategien der Immunevasion durch das ORF2-Protein entscheidend für eine persistierende HEV-Replikation sind, die trotz einer kontinuierlichen, jedoch abgeschwächten antiviralen Antwort aufrechterhalten wird.

Die Erkenntnisse meiner Doktorarbeit haben wesentlich dazu beigetragen, die vielfältigen Funktionen des HEV-Kapsidproteins ORF2 im HEV-Lebenszyklus weiter aufzuklären. Darüber hinaus konnte ich die durch das ORF2-Protein vermittelten Strategien der Immunevasion als zentrale Faktoren für die HEV-Persistenz identifizieren. Diese Ergebnisse bilden eine Grundlage für zukünftige Studien, die sowohl die Interaktion zwischen HEV-infizierten Hepatozyten und professionellen Immunzellen als auch Unterschiede in der durch verschiedene HEV-Genotypen ausgelösten antiviralen Antwort analysieren werden. Letztlich werden solche Untersuchungen neue Einblicke in entscheidende Faktoren der Pathogenese akuter und chronischer HEV-Infektionen ermöglichen.