German Title: Untersuchung der mechanistischen Grundlagen der Chromothripsis-Initiation und der klonalen Evolution chromothriptischer Zellen

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Abstract

Chromothripsis is a form of genomic instability characterized by massive chromosomal shattering, resulting in complex rearrangements. This phenomenon affects 30-50% of all cancers and is strongly linked to poor prognosis. TP53 mutations are tightly associated with chromothripsis. Although several mechanisms have been proposed, the specific triggers, molecular processes driving chromothripsis and the precise sequence of events are still unclear. In particular, how TP53 loss exactly drives replication stress and genomic instability, ultimately leading to such catastrophic events, is poorly understood. Furthermore, the timing of telomere stabilization, which is essential for chromothriptic cells to survive and evade apoptosis, remains unresolved. Moreover, our current knowledge of chromothripsis initiation is largely based on artificially induced in vitro systems or retrospective genomic analyses of fully developed tumours. To address these challenges, I used skin-derived fibroblasts from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patients, which undergo spontaneous chromothripsis. In these fibroblasts, bulk whole genome sequencing (WGS) data showed chromothripsis at late passages (TP53−/−), whereas the matched early-passage (TP53+/−) cells did not show clonal chromothripsis. Through a combination of phenotypic assays and cutting-edge multiomics approaches, I performed a longitudinal study to investigate two major questions: i) what leads to chromothripsis, and ii) what gives chromothriptic cells a selective advantage to become dominant in a cell population. The longitudinal profiling revealed that as early-passage cells advanced towards the growth crisis, they lost the wildtype TP53 allele, thus triggering global hypertranscription and increased nucleotide consumption. Simultaneously, dysfunctional p53 impaired the pentose phosphate pathway, leading to reduced nucleotide synthesis, as evidenced by transcriptomic and proteomic analyses. This imbalance resulted in replication stress induced by a competition between transcription and replication for the limited nucleotide pool. As a consequence of replication stress and checkpoint dysregulation due to p53 functional loss, LFS cells exhibited increased telomere attrition, breakage-fusion-bridge (BFB) cycles, chromatin bridges, multipolar spindle formation, chromosome missegregation, and micronuclei formation. This cascade of events ultimately led to chromothripsis and massive complex rearrangements. In addition, Single-cell DNA analysis revealed a high heterogeneity across cells, along with frequent copy number losses, rare events and diverse chromothriptic events already at early passages. Conversely, post-crisis chromothriptic cells exhibited clonal chromothripsis and complex rearrangements. Notably, while most cells underwent apoptosis or negative selection, I found that a small subset of cells survived due to selective advantages and the activation of key adaptation mechanisms. iv These included telomere stabilization via alternative lengthening of telomeres (ALT) or TERT activation, extrachromosomal circular DNA (ecDNA) formation, gene fusions, oncogene activation, and loss of tumour suppressor genes. The activation of such mechanisms conferred the cells survival advantages, driving rapid expansion and clonal evolution. Thus, I captured the sequence of events, from the non-neoplastic cell population to the appearance of dominant clones carrying chromothriptic chromosomes. Taken together, this study unravels the complex interplay between p53 dysfunction, nucleotide metabolism, and genomic instability in the initial phases of chromothripsis, thus providing crucial insights into the first steps of chromothripsis-mediated cancer development. Consequently, these findings may guide future strategies for cancer prevention and therapeutic interventions.

Translation of abstract (German)

Chromothripsis ist eine Form der genomischen Instabilität, die durch massive chromosomale Umstrukturierungen gekennzeichnet ist und die zu komplexen Umlagerungen führt. Dieses Phänomen betrifft 30-50 % aller Krebsarten und ist stark mit einer schlechten Prognose verbunden. TP53-Mutationen stehen in engem Zusammenhang mit Chromothripsis. Obwohl mehrere Mechanismen vorgeschlagen wurden, sind die spezifischen Auslöser und molekularen Prozesse, die Chromothripsis antreiben, sowie die genaue Abfolge der Ereignisse noch immer unzureichend verstanden. Insbesondere ist unklar, wie der Verlust von TP53 den Replikationsstress und die genomische Instabilität antreibt, was letztlich zu solch katastrophalen Ereignissen führt. Zusätzlich bleibt der Zeitpunkt der Telomerstabilisierung, deren Entkommen vor der Apoptose essenziell ist, ungelöst. Darüber hinaus basiert unser aktuelles Wissen über die Auslösung der Chromothripsis größtenteils auf künstlich induzierten In-vitro-Systemen oder retrospektiven genomischen Analysen vollständig entwickelter Tumoren. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, verwendete ich Fibroblasten aus der Haut von Patienten mit Li-Fraumeni-Syndrom (LFS), bei welchen es zu spontaner Chromothripsis kommt. Bei diesen Fibroblasten zeigten die Daten der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) Chromothripsis bei späten Passagen (TP53-/-), während die entsprechenden Zellen bei frühen Passagen (TP53+/-) keine klonale Chromothripsis aufwiesen. Durch eine Kombination aus phänotypischen Tests und hochmodernen Multiomics-Analysen führte ich eine longitudinale Studie durch, um zwei Hauptfragen zu untersuchen: i) Was führt zu Chromothripsis? und ii) Welche selektiven Vorteile ermöglichen chromothriptischen Zellen, in einer Zellpopulation dominant zu werden? Die longitudinale Profilierung ergab, dass Zellen in der frühen Passage beim Fortschreiten in die Wachstumskrise das wildtypische TP53-Allel verloren und dadurch eine globale Hypertranskription und einen erhöhten Nukleotidverbrauch auslösten. Gleichzeitig beeinträchtigte das funktionsgestörte p53 den Pentosephosphatweg, was zu einer reduzierten Nukleotidsynthese führte, die durch transkriptomische und proteomische Analysen nachgewiesen wurde. Dieses Ungleichgewicht führte zu Replikationsstress, der durch den Wettbewerb zwischen Transkription und Replikation um den begrenzten Nukleotidpool induziert wurde. Als Folge des Replikationsstresses und der Checkpoint-Dysregulation aufgrund des Verlusts der p53-Funktion wiesen LFS-Zellen eine erhöhte Telomerverkürzung, Breakage-Fusion-Bridge (BFB)-Zyklen, Chromatinbrücken, multipolare Spindelbildung, Chromosomenfehlsegregation und Mikronuklei-Bildung auf. Diese Kaskade von Ereignissen führten schließlich zu Chromothripsis und massiven komplexen Umlagerungen. Darüber hinaus zeigte die Einzelzell-DNA-Analyse eine hohe Heterogenität zwischen den Zellen, vi zusammen mit häufigen Verlusten der Kopienzahl, seltenen Ereignissen und vielfältigen chromothriptischen Ereignissen bereits in frühen Passagen. Im Gegensatz dazu wiesen post-Krise-chromothriptische Zellen klonale Chromothripsis und komplexe Umlagerungen auf. Bemerkenswerterweise, Während die Mehrheit der Zellen der Apoptose oder negativen Selektion unterlag, stellte ich fest, dass eine kleine Untergruppe aufgrund selektiver Vorteile und der Aktivierung zentraler Anpassungsmechanismen überlebte. Diese umfassten die Telomerstabilisierung durch alternative Telomerverlängerung (ALT) oder TERT-Aktivierung, Bildung extrachromosomaler zirkulärer DNA (ecDNA), Genfusionen, Onkogenaktivierung und Verlust von Tumorsuppressorgenen. Die Aktivierung dieser Mechanismen verschaffte den Zellen Überlebensvorteile, was zu einer schnellen Expansion und klonale Evolution führte. Somit erfasste ich die Abfolge von Ereignissen, von den nicht-neoplastischen Zellpopulationen bis zum Auftreten dominanter Klone mit chromothriptischen Chromosomen. Zusammenfassend entschlüsselt diese Studie das komplexe Zusammenspiel zwischen p53-Dysfunktion, Nukleotid-Stoffwechsel und genomischer Instabilität in den frühesten Phasen der Chromothripsis und liefert somit entscheidende Erkenntnisse über die ersten Schritte der chromothripsis-vermittelten Krebsentstehung. Folglich könnten diese Ergebnisse zukünftige Strategien zur Krebsprävention und therapeutischen Interventionen leiten.