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Abstract

Gene therapy using adeno-associated virus (AAV)-based vectors has advanced significantly in recent years, with multiple approved therapeutics now available on the market. Engineering of the capsid, transgene, and promoters has shown immense potential to improve the safety and efficacy of these drugs. The only vector component that has mostly remained in its original state is the viral replication origin, the inverted terminal repeats (ITRs). Several ITR variants have so far shown potential to improve vector efficacy and safety as well, implying that the parallel screening of large ITR libraries could improve the identification of superior variants. The reason this has never been attempted for variants of the central part of the ITR may be the strong secondary structure of the ITRs, severely impairing the cloning of novel variants. Additionally, the partial loss of the ITRs due to processing by the host’s DNA repair machinery prohibits tracing of the ITR variants upon transduction. To overcome these bottlenecks, a rarely used plasmid design was harnessed in the present work to facilitate the cloning of more than 110 newly designed ITR variants. This was complemented with a novel Sanger sequencing based method for fast and reliable ITR sequence verification in plasmid DNA, which proved effective for all conventional and most alternative ITR structures. To trace the ITR variants during production and transduction, they were tagged with a barcode sequence in the transgene of the vector genome. Intriguingly, after vector production with a pool of ITR variants, the barcoding also enabled the identification of a novel ITR repair pathway that relies on the presence of ITR sequences as repair templates in trans. This ITR trans-repair was detectable in all parts of the ITR and impedes the barcode-ITR association in pooled productions. Importantly, though, this repair could be circumvented by separate production of each ITR variant, which also facilitated the maintenance of highly diverse ITR hairpin sequences within vector genomes. Subsequently, after confirmation of the vector hairpin integrity in 90 ITR variants with high similarity to the wild-type ITR of AAV2 (wtITR2), the vectors were screened in vitro and in vivo for their effects on transduction. This revealed that the wtITR2 exhibited superior functionality in vitro but not in vivo, suggesting an immense potential for alternative ITR variants to improve transgene expression in human patients. As AAV vectors exhibit semi-random integration into the host genome, which could lead to adverse events in patients, a method was developed that enables interrogation of ITR-associated barcodes as well as the integration region. This allows the quantification of the integration propensity of different ITR variants, thereby complementing the comprehensive pipeline to screen for effects of ITR modifications on vector functionality. Long-term gene expression mediated by AAV vectors relies on vector genomes persisting in the cell as circular episomes or integrated into the host genome. To avoid the reliance on ITR sequences for vector genome circularization by the inefficient host cell machinery and to reduce the risks associated with host genome integration, the packaging of circular DNA genomes in AAV capsids may represent an alternative strategy to enhance the safety and efficacy of AAV-based gene therapy. Therefore, the possibility of generating circular vector genomes using a circovirus-inspired engineered AAV replication origin was examined. As hoped for, this generated circular replication intermediates using the AAV replication machinery, although packaging in AAV particles in a circular conformation was not detected. Collectively, this work has yielded a pipeline for (i) the generation of ITR variant plasmids, (ii) the validation of the ITR sequence in the plasmids, (iii) the confirmation of ITR integrity in the vector genomes, (iv) the analysis of transduction of ITR variants by barcodes, and (v) the interrogation of the effects of ITR variants on host genome integration. Taken together, this forms a comprehensive basis for larger-scale ITR variant screens. Concomitantly, the validation of the formation of circular replication intermediates could serve as a starting point to engineer AAV vectors with circular genomes. As a whole, the results of this work could therefore facilitate and accelerate the development of next-generation AAV gene therapy vectors.

Translation of abstract (German)

Die Gentherapie mit Vektoren auf der Basis von Adeno-assoziierten Viren (AAV) hat in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht, insbesondere durch mehrere bereits für den Markt zugelassene Medikamente. Die Modifikation des Kapsids sowie die Optimierung des Transgens und der Promotoren haben dabei ein immenses Potenzial zur Verbesserung der Sicherheit und Wirksamkeit dieser Medikamente gezeigt. Die einzige Vektorkomponente, die größtenteils in ihrem ursprünglichen Zustand geblieben ist, sind die viralen Replikationsursprünge, die Inverted Terminal Repeats (ITRs). Mehrere ITR-Varianten haben bisher das Potenzial gezeigt, die Wirksamkeit und Sicherheit der AAV-basierten Vektoren zu verbessern, weshalb ein paralleles Screening großer ITR-Bibliotheken die Identifizierung überlegener Varianten vereinfachen könnte. Der Grund dafür, dass dies für Varianten des zentralen Teils des ITR noch nie versucht wurde, könnte die starke Sekundärstruktur der ITRs sein, die das Klonieren neuer Varianten erschwert. Außerdem verhindert der teilweise Verlust der ITRs währed der Verarbeitung durch die DNA-Reparaturmaschinerie des Wirts die Rückverfolgung der ITR-Varianten nach der Transduktion. Um diese Engpässe zu überwinden, wurde in der vorliegenden Arbeit ein selten genutztes Plasmid-Design verwendet, das die Klonierung von mehr als 110 neuentworfenen ITR-Varianten vereinfachte. Ergänzt wurde dies durch eine neuartige, auf Sanger-Sequenzierung basierende Methode zur schnellen und zuverlässigen Verifizierung der ITR-Sequenz in Plasmid-DNA, die sich sowohl für konventionelle als auch für die meisten alternativen ITR-Strukturen als funktional erwies. Um die ITR-Varianten während der Produktion und Transduktion zu verfolgen, wurden sie mit einer Barcode-Sequenz im Transgen des Vektorgenoms ausgestattet. Bemerkenswert ist, dass das Barcoding bei der Vektorproduktion mit einem Pool von ITR-Varianten auch die Identifizierung eines neuartigen ITR-Reparaturmechanismus ermöglichte, der auf der Anwesenheit von ITR-Sequenzen in trans basiert, welche als Reparaturmuster dienen. Dieser ITR-trans-Reparaturmechanismus war in allen Teilen des ITR nachweisbar und verhindert die Barcode-ITR-Assoziation in gepoolten Produktionen. Allerdings konnte diese Reparatur durch die separate Produktion der einzelnen ITR-Varianten umgangen werden, was sogar die Erhaltung von Hairpin-Sequenzen in den Vektorgenomen ermöglichte, welche stark von AAV ITRs abweichen. Nach der Überprüfung der Vektor ITR Integrität in einer Bibliothek von 90 ITR-Varianten mit hoher Ähnlichkeit zur Wildtyp-(wt)AAV2-Sequenz wurden die Vektoren in vitro und in vivo auf ihre Auswirkungen auf die Transduktion untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass der AAV2 wtITR (wtITR2) in vitro, nicht aber in vivo eine höhere Funktionalität aufweist, was auf ein großes Potenzial für alternative ITR-Varianten zur Verbesserung der Transgenexpression bei Patienten schließen lässt. Da die Integration von AAV-Vektoren in das Wirtsgenom semi-randomisiert erfolgt, was zu unerwünschten Nebenwirkungen bei Patienten führen könnte, wurde eine Methode entwickelt, mit der die ITR-assoziierten Barcodes sowie die Integrationsregion gleichzeitig bestimmt werden können. Dies erlaubt eine Quantifizierung der Integrationsneigung verschiedener ITR-Varianten und vervollständigt so die umfassende Pipeline zum Screening der Auswirkungen von ITR-Modifikationen auf die Vektorfunktionalität. Die durch AAV-Vektoren vermittelte langfristige Genexpression hängt davon ab, dass die Vektorgenome als zirkuläre Episomen in der Zelle persistieren oder in das Wirtsgenom integriert werden. Um die Abhängigkeit der Zirkularisierung des Vektorgenoms von ITR Sequenzen durch die ineffiziente Reparaturmaschinerie der Wirtszelle zu vermeiden und gleichzeitig die mit der Integration des Wirtsgenoms verbundenen Risiken zu verringern, könnte die Verpackung zirkulärer DNA-Genome in AAV-Kapsiden eine alternative Strategie zur Verbesserung der Sicherheit und Wirksamkeit der AAV-basierten Gentherapie sein. Daher wurde die Möglichkeit untersucht, zirkuläre Vektorgenome mit Hilfe eines von Circoviren inspirierten AAV-Replikationsursprungs zu erzeugen. Wie erhofft, wurden dabei mit Hilfe der AAV-Replikationsmaschinerie zirkuläre Replikationsintermediate erzeugt, deren Verpackung in AAV-Partikel in zirkulärer Konformation jedoch nicht nachgewiesen werden konnte. Damit hat diese Arbeit eine Pipeline für (i) die Klonierung von Plasmiden mit ITR-Varianten, (ii) die Validierung der ITR-Sequenz in den Plasmiden, (iii) die Bestätigung der ITR-Integrität in den Vektorgenomen, (iv) die Analyse der Transduktion von ITR-Varianten durch Barcodes und (v) die Untersuchung der Auswirkungen von ITR-Varianten auf die Integration in das Wirtsgenom hervorgebracht. Zusammengenommen bildet dies eine umfassende Grundlage für groß angelegte ITR-Varianten-Screens. Die Validierung der Bildung von zirkulären Replikationsintermediaten könnte als Ausgangspunkt für die Entwicklung von AAV-Vektoren mit zirkulären Genomen dienen. In ihrer Gesamtheit könnten die Ergebnisse dieser Arbeit daher die Entwicklung von AAV-Gentherapie-Vektoren der nächsten Generation erleichtern und beschleunigen.