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Abstract

Congenital disorders of glycosylation (CDG) are a group of rare metabolic diseases caused by mutations in the enzymes involved in glycosylation. To date, no conclusive pathogenic mechanism is linked to the disease and there are only limited therapeutic options available. The most common form of CDG is caused by compound heterozygous hypomorphic alleles of the cytosolic enzyme Phosphomannomutase 2 (PMM2), leading to global protein hypoglycosylation and a multiorgan phenotype in patients. Complete loss-of-function mutations in the essential protein are incompatible with life. Patients that survive carry mutations that lead to reduced enzyme activity of PMM2. PMM2 plays a crucial role at the basis of the glycosylation cascade in the endoplasmic reticulum by providing the essential mannose precursor required for the three glycosylation routes N-glycosylation, O- and C-mannosylation. The entire glycosylation machinery is evolutionarily highly conserved which allows generating translational models in other organisms. The small teleost medaka (Oryzias latipes) offers a great advantage as model organism to investigate the early embryogenesis through the extrauterine and transparent developing embryos. To understand acute effects of Pmm2 loss on development and disease progression, I have created translational models that mimic the reduced residual enzyme activity of PMM2-CDG patients. I followed two routes to investigate the role of PMM2 on development: establish a conditional knockdown system for acute Pmm2 interference at the protein level and patient-based genetic models by precision genome editing in medaka. For the conditional knockdown in medaka, I applied an inducible degron system to selectively degrade Pmm2-GFP, mimicking reduced enzyme activity. To generate patient-based pmm2 alleles, I used canonical base editing to generate the p.C139R mutation and a deletion variant. Further, I developed and carefully examined a novel two step one-shot base editing approach termed “inception”. Inception introduces a new binding site for a second base editing event that subsequently leads to the anticipated edit. With inception I created one of the common patient mutations p.F119L. Depending on the generated alleles, different pmm2 variants resulted in varying enzymatic activity in medaka, phenocopied the patient symptoms and caused hypoglycosylation of proteins. Bottom-up proteomics revealed molecular changes already present before the onset of multisystemic phenotypes, affecting particularly mRNA processing and eye development.

Translation of abstract (German)

Angeborene Stoffwechselkrankheiten, die Proteinglykosylierung betreffen, werden als „Congenital Disorder of Glycosylation“ (CDG) bezeichnet. Dies ist eine Gruppe seltener Erkrankungen, die durch Mutationen in den Enzymen des Glykosylierungsprozesses verursacht werden. Bisher ist kein Mechanismus bekannt, der die Pathogenese der Krankheit erklären kann und therapeutische Optionen sind nur begrenzt verfügbar. Die häufigste Form der CDG wird durch heterozygote hypomorphe Allele des zytosolischen Enzyms Phosphomannomutase 2 (PMM2) verursacht, die bei den Patienten zu einer globalen Hypoglykosylierung der Proteine und einem multisystemischen Phänotyp führen. Mutationen des PMM2 Genes, die zu einem vollständigen Funktionsverlust führen, sind embryonal lethal. Daher liegt nahe, dass überlebende Patienten Mutationen tragen, die zu einer reduzierten Funktionalität von PMM2 führen. PMM2 spielt eine entscheidende Rolle am Anfang der Glykosylierungskaskade im endoplasmatischen Retikulum, indem es den essenziellen Mannose-Vorläufer für die drei Glykosylierungsprozesse N-Glykosylierung, O- und C-Mannosylierung bereitstellt. Der gesamte Glykosylierungsprozess ist evolutionär hoch konserviert und ermöglicht daher dessen Erforschung in Modellorganismen. Der kleine Teleost Medaka (Oryzias latipes) bietet einen großen Vorteil als Modellorganismus, da die frühe Embryogenese durch die extrauterine Entwicklung der Embryonen in transparenten Eischalen untersucht werden kann. Um die akuten Auswirkungen des Pmm2-Verlusts auf die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit zu verstehen, habe ich translationale Tiermodelle geschaffen, die die reduzierte Restaktivität des Enzyms von PMM2-CDG-Patienten nachahmen. Um die Rolle von PMM2 auf die Entwicklung zu untersuchen, habe ich zwei Ansätze verfolgt: die Etablierung eines induzierbaren Degron-Systems für einen akuten Abbau des Pmm2 Proteins und patientenbasierte genetische Modelle durch präzise Genome-Editierung in Medaka. Für den gezielten Abbau des Pmm2 Proteins habe ich ein induzierbares System für den akuten Proteinabbau in Medaka angewandt. Dieses erkennt gezielt GFP-markierte Pmm2 Proteine und führt zum Proteinabbau, um die reduzierte Enzymaktivität nachzuahmen. Zur Erzeugung patientenbasierter pmm2 Allele verwendete ich etablierte Basen-Editoren, um die Mutation p.C139R und eine Deletionsvariante des Gens zu erzeugen. Darüber hinaus habe ich ein neuartiges zweiteiliges Edit-Verfahren entwickelt und untersucht: den so genannten „Inception“ Ansatz. Bei der Inception wird eine neue Bindungsstelle für ein zweites Editierungsereignis eingeführt, das anschließend zu der erwarteten Veränderung führt. Mit Inception habe ich eine der häufigen Patientenmutationen p.F119L erzeugt. Abhängig von den erzeugten Allelen führten verschiedene pmm2 Varianten zu unterschiedlicher Enzymaktivität in Medaka, was eine generelle Hypoglykosylierung von Proteinen verursachte und zu den von Pmm2-CDG Patienten bekannten Symptomen im Fischmodell führte. Bottom-up-Proteomik-Untersuchungen zeigten molekulare Veränderungen, die bereits vor dem Auftreten der multisystemischen Phänotypen vorhanden waren und insbesondere die mRNA-Prozessierung und Augenentwicklung betrafen.