German Title: Entschlüsselung von Mechanismen zur Steigerung der Reaktivität von NK-Zellen gegen Darmkrebs

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Abstract

Natural Killer (NK) cells play a critical role in targeting and destroying malignant cells, rendering NK cells as promising candidates for cancer immunotherapy. To predict, which patients would benefit the most from NK cell-based therapies, suitable model systems are of urgent need. Here, I established a NK cell/patient-derived organoid (PDO) co-culture platform, allowing the assessment of reciprocal immune/tumor cell interactions. I could unveil that NK cell cytotoxicity and activation - measured by downregulation of CD16 and upregulation of CD25 and CD49a - is time-, PDO-, and cell contact-dependent as well as lower in NK cell co-cultures with intact (3D) PDOs when compared to dissociated single cell PDOs (2D). Moreover, I could stratify PDOs into NK cell-susceptible and -resistant PDOs, based on the degree of NK cell-mediated PDO lysis, NK cell activation, and the NK cell ligandome expressed on PDOs. Using bulk RNA sequencing analysis, I demonstrated that the comparison of PDOs cultured alone resulted in up to twice as many gene expression changes as when comparing NK cell-exposed PDOs to their respective PDOs cultured alone. Since both NK cell-susceptible and -resistant PDOs exhibited a strong IFN-γ-related transcriptional footprint after co-culture with NK cells, I tested addition of IFN-γ to PDOs and observed increased PDO apoptosis rates, reduced PDO proliferation as well as higher frequencies of HLA-A, B and C-expressing PDOs. While the upregulation of HLA-A, B and C on NK cell-exposed PDOs barley affected NK cell cytotoxicity, knockout of B2M in PDOs, which completely abrogated the expression of HLA-A, B and C on PDOs, strongly potentiated NK cell-mediated PDO lysis as well as NK cell activation. Overall, co-culture with NK cell-susceptible PDOs induced more gene expression changes in NK cells than exposure to NK cell-resistant PDOs, when both were compared to NK cells cultured alone. While the downregulation of NK cell cytotoxicity- and upregulation of hypoxia- and transforming growth factor (TGF)-β-related transcripts was detectable in NK cells exposed to both NK cell-susceptible and -resistant PDOs, only in NK cells co-cultured with NK cell-susceptible PDOs, I observed prominent inflammation characteristics and signs of tissue residency. The inflammatory NK cell profile was marked by secretion of IFN-γ, IL-13, or CCL5, and NK cell tissue-residency markers included CD49a (ITGA1), CD103 (ITGAE), or CXCR6. Importantly, my NK cell/PDO co-culture-derived gene expression signatures aligned with the characteristics of colon cancer-infiltrated NK cells isolated from patient tumors, when compared to peripheral blood NK cells from the same individuals. Lastly, I targeted pathways with potential impact on NK cell reactivity that were enriched/reduced in the RNA sequencing dataset. Examples are HIF1A/EPAS1-edited primary NK cells or Galunisertib inhibiting TGF-βR1, both improving NK cell-mediated PDO killing. These therapeutic strategies could be further improved through combination with antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)-inducing monoclonal antibodies directed against CEACAM1 or by arming NK cells with a chimeric antigen receptor (CAR) directed against HER2. Ultimately, the NK cell/PDO co-culture platform enables the discovery of both common and patient-specific NK cell responses to the tumor microenvironment and can facilitate the development of patient-tailored NK cell-based therapies.

Translation of abstract (German)

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) spielen eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung und Zerstörung bösartiger Krebszellen. Diese Eigenschaft macht NK-Zellen zu vielversprechenden Kandidaten für die Krebsimmuntherapie. Um herauszufinden, welche Patienten am meisten von NK-Zell-zentrierten Therapien profitieren würden, werden dringend geeignete Modellsysteme benötigt. Deshalb habe ich eine Plattform entwickelt, auf der NK-Zellen gemeinsam mit von Patienten stammenden Organoiden kultiviert werden können. Dies ermöglichte die Untersuchung von wechselseitigen Interaktionen zwischen Immun- und Tumorzellen. Beispielsweise konnte ich damit aufzeigen, dass die NK-Zell-Zytotoxizität und Aktivierung - gemessen an der Herunterregulation von CD16 und Hochregulation von CD25 und CD49a - abhängig von der Kulturzeit, der 3D-Organoid-Struktur, den Organoiden selbst war und nur bei direktem NK-Zell-Kontakt zu Organoiden erfolgte. Anhand der Stärke der NK-Zell-Zytotoxizität, NK-Zell-Aktivierung und den NK-Zell-Liganden, welche auf den Organoiden exprimiert waren, konnte ich die Organoide in NK-Zell-suszeptible und-resistente Organoide einteilen. Mithilfe von RNA-Sequenzanalysen konnte ich zeigen, dass im direkten Vergleich zwischen Organoiden doppelt so viele Gene differentiell reguliert wurden, als wenn man die Organoide vergleicht, welche entweder mit NK-Zellen oder alleine kultiviert wurden. Da sowohl NK-Zell-suszeptible als auch -resistente Organoide nach der Kultur mit NK-Zellen einen starken IFN-γ Fußabdruck aufwiesen, testete ich die Zugabe von IFN-γ zu Organoiden. IFN-γ induzierte sowohl Organoid-Zelltod, eine verminderte Organoid-Teilungsfähigkeit, als auch eine erhöhte Expression von HLA-A, B und C Molekülen auf Organoiden. Die Hochregulation von HLA-A, B und C auf Organoiden, die mit NK-Zellen kultiviert wurden, beeinflusste die NK-Zell-Zytotoxizität kaum. Jedoch potenzierte die genetische Modifikation von B2M in Organoiden, welche die Expression von HLA-A, B und C vollständig aufhob, die NK-Zell-Zytotoxizität und -Aktivierung stark. Insgesamt induzierte die Kultur mit NK-Zell-suszeptiblen Organoiden stärkere Veränderungen der Genexpressionsmuster in NK-Zellen als die Kultur mit NK-Zell-resistenten Organoiden, jeweils im Vergleich zu den NK-Zellen, die ohne Organoide kultiviert wurden. Beispiele für Genexpressionsanpassungen in NK-Zellen, die sowohl in NK-Zell-suszeptiblen als auch -resistenten Organoiden ersichtlich waren, sind die Herunterregulation von NK-Zell-Zytotoxizität- und Hochregulation von Hypoxie- und TGF-β-Signalwegen. Lediglich in NK-Zellen, welche mit NK-Zell-suszeptiblen Organoiden kultiviert wurden, war eine Erhöhung von Entzündungssignalwegen sichtbar, was mit der erhöhten Sekretion von IFN-γ, IL-13 und CCL5 einherging. Des Weiteren zeigten diese NK-Zellen auch gewebespezifische Merkmale auf, wie beispielsweise die Expression von CD49a, CD103 und CXCR6. Hierbei ist es wichtig zu erwähnen, dass alle NK-Zell/Organoid-Signaturen mit den Eigenschaften von NK-Zellen übereinstimmten, die aus primären Darmkrebsgeweben isoliert wurden - im Vergleich zu NK-Zellen aus dem peripheren Blut derselben Patienten. Zuletzt habe ich mich auf Signalwege konzentriert, die einen potenziellen Einfluss auf die Reaktivität der NK-Zellen haben und die im RNA-Sequenzierungsdatensatz angereichert/reduziert waren. Beispiele hierfür sind NK-Zellen, in denen ich die HIF1A/EPAS1-Gene ausgeschnitten habe oder chemische Substanzen wie Galunisertib, welches den TGF-β Rezeptor 1 blockiert. Diese therapeutischen Ansätze könnten durch die Kombination mit monoklonalen Antikörpern, die gegen CEACAM1 gerichtet sind und antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) induzieren oder auch mit HER2-chimären Antigenrezeptor-(CAR)-NK-Zellen weiter verbessert werden. Zusammenfassend ermöglicht diese Plattform die Entdeckung sowohl allgemeiner als auch patientenspezifischer Anpassungen von NK-Zellen an das Krebsgewebe und wird hoffentlich die Entwicklung patientenindividueller NK-Zell-basierter Therapien erleichtern.