German Title: Erforschung der Ionensensor-Eigenschaften von Cystein-Derivaten für die Kohlenstoff-13 Magnetresonanzspektroskopie

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Abstract

Ion homeostasis, in terms of pH, copper (Cu²⁺), and zinc (Zn²⁺) levels, plays a crucial role in cellular function, with significant deviations in pathologies such as cancer. A possibility to assess the ion balance in living tissue is the quantification of nuclear magnetic resonance (NMR) properties, such as chemical shifts of carbon-13 (13C)-enriched spin tracers that can be injected into tissue. This thesis explores cysteine derivatives as such ion sensors for 13C magnetic resonance spectroscopy (MRS), focusing on their responsiveness to physiologically relevant biomarkers such as pH, Zn²⁺, and Cu²⁺, as well as their biocompatibility and potential for hyperpolarization through dissolution dynamic nuclear polarization (d-DNP). To this end, four candidate molecules were synthesized – the cysteine derivatives (R)-2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid (OTZ), Ethyl-OTZ, OTZ-glutamine (OTZ-Gln), and OTZ-histidine (OTZ-His). Initial evaluation of Ethyl-OTZ revealed limited solubility in aqueous solutions; thus, it was excluded from further analysis. The other derivatives were extensively characterized using natural abundance 13C MRS and competitive titrations. OTZ and OTZ-Gln responded notably to Cu²⁺, but their responses to Zn²⁺ were limited, and they were insensitive to pH changes. In contrast, OTZ-His demonstrated notable 13C chemical shift and line width changes under all conditions tested, leading to its selection for detailed analysis. 13C NMR studies at 25°C and 37°C revealed significant shifts up to 1.94 ppm across the physiological pH range, while line widths remained largely unchanged. When exposed to 0.05 mM Cu²⁺, OTZ-His exhibited substantial changes in chemical shift (up to 1.88 ppm) and line width increases (up to 267 %). OTZ-His also responded significantly to 25 mM Zn²⁺, with chemical shift changes up to 2.13 ppm and line width increases up to 300 %. Competitive binding assays confirmed this strong affinity of OTZ-His for Cu²⁺ and moderate affinity for Zn²⁺. The compound remained stable for 14 weeks. However, OTZ-His affected the viability of HepG2 cells in a dose-dependent manner, indicating the need for further biocompatibility testing. Nonetheless, OTZ-His remains a promising candidate for a future, versatile application in hyperpolarized 13C MRS in vivo.

Translation of abstract (German)

Die Ionenhomöostase in Bezug auf den pH-Wert sowie Kupfer- (Cu²⁺) und Zink- (Zn²⁺) Konzentrationen spielt eine zentrale Rolle für die zelluläre Funktion und zeigt bei Erkrankungen wie Krebs signifikante Abweichungen. Eine Möglichkeit zur Beurteilung des Ionengleichgewichts im lebenden Gewebe ist die Quantifizierung von Eigenschaften der Kernspinresonanz (NMR), wie beispielsweise chemische Verschiebungen von mit Kohlenstoff-13 (13C) angereicherten Spin-Tracer-Molekülen, die in das Gewebe injiziert werden können. Diese Arbeit untersucht Cystein-Derivate als solche Ionensensoren für die 13C-Magnetresonanzspektroskopie (MRS) und konzentriert sich dabei auf ihr Verhalten gegenüber physiologisch relevanten Biomarkern wie pH, Zn²⁺ und Cu²⁺ sowie auf ihre Biokompatibilität und ihr Potenzial zur Hyperpolarisation durch dynamische Kernpolarisation (d-DNP). Zu diesem Zweck wurden vier Kandidatenmoleküle synthetisiert - die Cystein-Derivate (R)-2-Oxothiazolidin-4-carbonsäure (OTZ), Ethyl-OTZ, OTZ-Glutamin (OTZ-Gln) und OTZ-Histidin (OTZ-His). Die erste Evaluierung von Ethyl-OTZ zeigte eine begrenzte Löslichkeit in wässriger Lösung, weshalb es von weiteren Analysen ausgeschlossen wurde. Die übrigen Derivate wurden umfassend mittels 13C MRS und kompetitiven Titrationen charakterisiert. OTZ und OTZ-Gln sprachen deutlich auf Cu²⁺ an, zeigten jedoch nur begrenzte Antwort auf Zn²⁺ und waren gegenüber pH-Änderungen unempfindlich. Im Gegensatz dazu zeigte OTZ-His unter allen getesteten Bedingungen signifikante Änderungen der chemischen Verschiebung oder der Linienbreite im 13C-Kernspinresonanzspektrum, was zu seiner Auswahl für eine detaillierte Analyse führte. 13C MRS Messungen bei 25 °C und 37 °C zeigten über den physiologischen pH-Bereich signifikante Änderungen der chemischen Verschiebung von bis zu 1,94 ppm, während die Linienbreiten weitgehend unverändert blieben. Die Exposition von OTZ-His gegenüber 0,05 mM Cu²⁺ führte zu signifikanten Änderungen der chemischen Verschiebungen (bis zu 1,88 ppm) und der Linienbreiten (bis zu 267 %). Die Zugabe von 25 mM Zn²⁺ führte zu signifikanten Änderungen der chemischen Verschiebungen (bis zu 2,13 ppm) und der Linienbreiten (bis zu 300 %). Kompetitive Titrationen bestätigten die starke Affinität von OTZ-His für Cu²⁺ und die moderate Affinität für Zn²⁺. Die Verbindung blieb über 14 Wochen lang stabil. Allerdings beeinflusste OTZ-His die Zellviabilität von HepG2-Zellen in einer dosisabhängigen Weise, was weitere Biokompatibilitätstests erforderlich macht. Dennoch erweist sich OTZ-His als vielversprechender Kandidat für zukünftige, vielseitige Anwendungen in der hyperpolarisierten 13C-MRS in vivo.