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PDF, English - main document Download (13MB) | Lizenz: Dissecting chromatin state transitions and HP1alpha function at pericentric heterochromatin through targeted perturbation and imaging by Weinmann, Robin underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0

Abstract

The organization of chromatin into functional chromatin subcompartments (CSCs) is essential for gene regulation. Pericentric heterochromatin (PCH) assembles at repetitive satellite sequences in mouse cells and forms compact, transcriptionally silenced structures known as chromocenters which are maintained by a repressive network including heterochromatin protein 1 (HP1). Disruption of PCH organization has been linked to increased satellite repeat transcription and chromosomal instability, and is observed in developmental diseases and cancer. Despite its importance, the molecular mechanisms by which PCH can transition into a decondensed and transcriptionally active state as part of its deregulation, as well as the role of HP1alpha in this process, remain unclear. In this thesis, I established DART (dCas9 Activator Recruitment Toolbox) and COBRA (Co-Binding Reporter Array) and applied them to dissect the structure-function relationships of PCH in differentiated mouse cells and to characterize the repressive function of HP1alpha in this context. Using DART and super-resolution microscopy revealed that chromocenters are organized in subclusters which do not fully disperse upon decondensation. I showed that both acetylation and transcription can induce decondensation of chromocenters, uncoupled from each other. These findings led to the model, that decondensation is facilitated by charge changes through either acetylation or active transcription. Histone acetylation and transcription activation was observed even in the continued presence of heterochromatin marks like H3K9me3 and HP1alpha, which were not evicted from chromocenters upon activation. In fact, HP1alpha localization and binding dynamics remained largely unaffected by chromocenter perturbation. Using COBRA, HP1alpha was characterized as a direct repressor of transcription when promoter proximal and likely contributed to a protective layer against transcription activation of satellite sequences in the endogenous context. Together, these findings support a model in which chromocenters consist of repeat units capable of switching between active and repressed states through localized interactions, without the need to invoke phase separation. Taken together, this thesis establishes a framework for manipulating and probing CSC states in living cells and highlights the complex interplay between structural chromatin features and transcriptional regulation.

Translation of abstract (German)

Die Organisation von Chromatin in funktionelle chromatische Subkompartimente (CSCs) ist entscheidend für die Genregulation. Perizentrisches Heterochromatin (PCH) lagert sich an repetitiven Satellitensequenzen in Mauszellen an und bildet kompakte, transkriptionell stille Strukturen, die als Chromozentren bezeichnet werden und durch ein repressives Netzwerk, einschließlich des Heterochromatinproteins 1 (HP1), aufrechterhalten werden. Eine Störung der PCH-Organisation wurde mit erhöhter Transkription von Satellitensequenzen und chromosomaler Instabilität in Verbindung gebracht und wird bei Entwicklungsstörungen und Krebs beobachtet. Trotz seiner Bedeutung sind die molekularen Mechanismen, durch die PCH im Rahmen seiner Deregulierung in einen dekondensierten und transkriptionell aktiven Zustand übergehen kann, sowie die Rolle von HP1α in diesem Prozess bislang unklar. In dieser Arbeit habe ich DART (dCas9 Activator Recruitment Toolbox) und COBRA (Co-Binding Reporter Array) etabliert und eingesetzt, um die Struktur-Funktions-Beziehungen von PCH in differenzierten Mauszellen zu untersuchen und die repressive Funktion von HP1 in diesem Kontext zu charakterisieren. Der Einsatz von DART in Kombination mit Super-Resolution-Mikroskopie zeigte, dass Chromozentren in Subclustern organisiert sind, die sich bei Dekondensation nicht vollständig auflösen. Ich konnte zeigen, dass sowohl Acetylierung als auch Transkription die Dekondensation von Chromozentren auslösen können, wobei diese Prozesse voneinander entkoppelt sind. Diese Ergebnisse führten zu dem Modell, dass Dekondensation durch Ladungsänderungen infolge von Acetylierung oder aktiver Transkription erleichtert wird. Histonacetylierung und Transkriptionsaktivierung traten selbst bei fortbestehender Präsenz von Heterochromatinmarkierungen wie H3K9me3 und HP1α auf, die bei der Aktivierung nicht aus den Chromozentren verdrängt wurden. Tatsächlich blieben die Lokalisierung und Bindungsdynamik von HP1α bei Chromozenterstörungen weitgehend unbeeinflusst. Mithilfe von COBRA wurde HP1α als direkter Repressor der Transkription in promoterproximen Regionen charakterisiert und trägt vermutlich zur schützenden Barriere gegen die Transkriptionsaktivierung von Satellitensequenzen im endogenen Kontext bei. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse ein Modell, in dem Chromozentren aus Wiederholungseinheiten bestehen, die durch lokale Interaktionen zwischen einem aktiven und einem repressiven Zustand wechseln können, ohne dass eine Phasentrennung erforderlich ist. Insgesamt etabliert diese Arbeit ein methodisches Rahmenwerk zur gezielten Manipulation und Untersuchung von CSC-Zuständen in lebenden Zellen und hebt das komplexe Zusammenspiel zwischen strukturellen Chromatinmerkmalen und transkriptioneller Regulation hervor.