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Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rare, devastating, currently incurable neurodegenerative disease. Despite numerous efforts in recent years, there is still no widely effective treatment available. In a subset of ALS patients, aggregation of the mutant human superoxide dismutase (hSOD1) protein drives the development and progression of ALS. Stabilization of hSOD1’s catalytically active, native homodimer state prevents dissociation into aggregation-prone and disease relevant monomers. To this end, the development of dimer-stabilizing non-covalent ligands was pursued. Small molecule ligands were designed to target the Val148 cavity of the hSOD1 dimer interface. The ligands lead structure, comprised of a central functionalized biphenyl moiety with a third functionalized benzene moiety connected via an amide linker, was retrosynthetically disconnected into three structural fragments. These fragments were systematically varied and combinatorially reconnected in silico, affording a library of 320 virtual ligands. Aiming to identify both, the most essential fragments, as well as the most promising ligand structures, molecular docking was utilized to screen the virtual ligand library. Based on the in silico prediction, twelve small molecule ligands were synthesized. Featuring amide coupling and Suzuki–Miyaura coupling as key derivatization steps, a concise modular organic synthesis route was developed. In order to provide an in vitro model of hSOD1-ALS pathology, recombinant expression of the hSOD1 and hSOD1 A4V proteins was established. Aiming to closely mimic physiological conditions, emphasis was placed on ensuring the presence of SOD1’s native maturation modifications. Mass spectrometry confirmed native Cu2+ and Zn2+ metalation and the formation of the intrasubunit disulfide bond. Demonstrating the enzymatic activity of hSOD1 and hSOD1 A4V proved correct folding and dimer-association. Taken together, this verified that hSOD1 and hSOD1 A4V were obtained in their native states. The ligands inhibitory effect on hSOD1 A4V aggregation was investigated in multiple complementary in vitro assays. A thioflavin T based aggregation assay served as a screening tool. Eleven ligands and two literature known compounds were assessed and three ligands were identified as putative hits. Dynamic light scattering confirmed these three hits and in addition, provided estimates of the particle sizes of the formed hSOD1 aggregates in solution. Electron microscopy revealed hSOD1 A4V aggregate morphology under the incubation conditions utilized in this work. The initial molecular docking study was evaluated in light of the experimental observations. This highlighted it as a valuable asset, as it had correctly predicted two of the in vitro identified hits. Furthermore, ligand binding modes were proposed by molecular docking and two hit ligands shared a proposed binding mode. In conclusion, three of the developed hSOD1 stabilizing small molecule ligands were demonstrated to reduce the formation of ALS-relevant hSOD1 A4V aggregates. Their effectiveness was confirmed by two complementary in vitro assays and rigorous evaluation of experimental results. These ligands provide valuable tools for the elucidation of hSOD1-ALS disease pathology and related research. One ligand in particular was highlighted as a potent lead compound for the development of a therapeutic treatment of hSOD1-ALS.

Translation of abstract (German)

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine seltene, schwere und derzeit unheilbare neurodegenerative Erkrankung. Trotz der zahlreicher Anstrengungen der letzten Jahre gibt es noch immer keine allgemein anwendbare, wirksame Behandlung. Bei einer Untergruppe von ALS-Patienten wird die Krankheit durch die Aggregation des mutierten menschlichen Superoxiddismutase (hSOD1)-Proteins verursacht und vorangetrieben. Die Stabilisierung des katalytisch aktiven, nativen Homodimer-Zustands von hSOD1 verhindert die Dissoziation in zu Aggregation neigende und krankheitsrelevante Monomere. Zu diesem Zweck wurde die Entwicklung von dimerstabilisierenden nicht-kovalenten Liganden verfolgt. Es wurden niedermolekulare Liganden entwickelt, die auf die Val148-Kavität der hSOD1-Dimer-Kontaktfläche abgestimmt sind. Die Leitstruktur der Liganden, bestehend aus einer zentralen funktionalisierten Dibenzol-Einheit, an die eine dritte funktionalisierte Benzol-Einheit über einen Amid-Linker angebunden ist, wurde retrosynthetisch in drei Strukturfragmente zerlegt. Diese Fragmente wurden systematisch variiert und in-silico kombinatorisch erschöpfend wieder zusammengefügt, wodurch eine Bibliothek von 320 virtuellen Liganden entstand. Mit dem Ziel, sowohl die wichtigsten Fragmente als auch die vielversprechendsten Ligandenstrukturen zu identifizieren, wurde die virtuelle Ligandenbibliothek mittels molekularem Docking untersucht. Ausgehend von der in-silico-Einschätzung wurden zwölf niedermolekulare Liganden synthetisiert. Dazu wurde ein zielgerichteter und direkter modularer organischer Syntheseweg mit Amidkopplung und Suzuki–Miyaura-Kopplung als entscheidende Derivatisierungsschritte entwickelt. Um ein in-vitro-Modell der hSOD1-ALS-Pathologie zu erlangen, wurde die rekombinante Expression der Proteine hSOD1 und hSOD1 A4V etabliert. Mit dem Ziel, den physiologische Bedingungen möglichst treu zu bleiben, wurde besonderer Wert darauf gelegt, das Vorhandensein der natürlichen Reifungsmodifikationen von SOD1 sicherzustellen. Massenspektrometrie bestätigte die native Metallierung mit Cu2+ und Zn2+, sowie die Ausbildung der Disulfidbrücke innerhalb der Untereinheiten. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität von hSOD1 und hSOD1 A4V bestätigte sowohl die korrekte Faltung als auch die Dimerassoziation. Insgesamt bestätigte dies, dass die Proteine hSOD1 und hSOD1 A4V in ihrem nativen Zustand vorlagen. Die inhibitorische Wirkung der Liganden auf die Aggregation von hSOD1 A4V wurde in mehreren komplementären in-vitro-Assays. Ein Thioflavin-T-basierter Aggregationsassay diente dabei als Musterungsinstrument. Elf synthetisierte Liganden und zwei weitere, literaturbekannte Verbindungen wurden untersucht. Dabei wurden drei Liganden als mutmaßliche Treffer identifiziert. Messungen der Dynamischen Lichtreuung bestätigten diese drei Treffer und ermöglichten darüber hinaus die Einschätzung der Partikelgrößen der in Lösung gebildeten hSOD1-Aggregate. Bei elektronenmikroskopische Untersuchungen konnten die Morphologien der hSOD1 A4V-Aggregate unter den in dieser Arbeit verwendeten Inkubationsbedingungen gezeigt werden. Die Eingangs durchgeführte molekulare Docking-Studie wurde unter Berücksichtigung der experimentellen Beobachtungen bewertet. Dadurch wurde hervorgehoben, dass sie einen wertvollen Beitrag geleistet hatte, da sie zwei der in-vitro identifizierten Treffer korrekt vorhergesagt hatte. Darüber hinaus wurden die Bindungsmodi der Liganden durch das molekulare Docking postuliert, wobei zwei der erfolgreichen Liganden einen gemeinsamen Bindungsmodus aufwiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass drei der entwickelten hSOD1-stabilisierenden niedermolekularen Liganden nachweislich die Bildung von ALS-relevanten hSOD1 A4V Aggregaten reduzieren. Ihre Wirksamkeit wurde durch zwei komplementäre in-vitro-Assays und eine strenge Bewertung der experimentellen Ergebnisse bestätigt. Diese Liganden sind wertvolle Werkzeuge für die Aufklärung der Pathologie, die der hSOD1-ALSErkrankung zugrunde liegt und der damit verbundenen Forschung. Insbesondere einer der Liganden wurde als potenter Leitwirkstoff für die Entwicklung einer therapeutischen Behandlung von hSOD1-ALS aufgezeigt.