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Abstract

Das Ewing-Sarkom (EwS) ist der zweithäufigste bösartige Knochen- und Weichgewebstumor, der vor allem Kinder, Jugendliche und junge Erwachsene betrifft. Er ist durch chromosomale Translokationen gekennzeichnet, die EWSR1::ETS Fusionsonkogene erzeugen, am häufigsten EWSR1::FLI1. Diese Genfusionen kodieren für aberrierende EWSR1::ETS-Transkriptionsfaktoren, die an spezifische DNA-Sequenzen (GGAA-Mikrosatelliten) binden, was zur Bildung von de- novo-Enhancern und einer weit verbreiteten Gendysregulation führt. Diese dysregulierten Gene beeinflussen kritische zelluläre Prozesse, darunter Angiogenese, Zellmigration, Proliferation und zellulärer Stoffwechsel. Auf funktionaler Ebene wurde der Phänotyp von EwS-Zellen mit den Expressionsniveaus und der Aktivität der EWSR1::ETS-Fusionsonkoproteine in Verbindung gebracht. Bei hoher EWSR1::ETS- Expression weisen EwS-Zellen einen undifferenzierten Zustand mit erhöhter Proliferationskapazität und verstärkten Zell-Zell-Interaktionen auf. Im Gegensatz dazu weisen Zellen mit geringer EWSR1::ETS-Expression einen mesenchymartigen Phänotyp auf, mit größeren Migrations-/Invasionskapazitäten und mehr Zell-Matrix- Interaktionen. Dieser Phänotyp, der der epithelialen-zu-mesenchymalen Transition (EMT) ähnelt, wurde mit Veränderungen des Zytoskeletts in Verbindung gebracht; seine Auswirkungen auf Stoffwechselmerkmale sind jedoch noch unerforscht. Der Kynurenin-Stoffwechselweg (Kyn) wandelt die essentielle Aminosäure Tryptophan (Trp) über drei Schlüsselenzyme in mehrere Metaboliten um, vor allem in Kyn und Kynurensäure (KynA): Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO1), Tryptophan-2,3- Dioxygenase (TDO2) und Interleukin-4-induziertes 1 (IL4I1). Kyn und KynA sind die wichtigsten endogenen Liganden, die den Arylhydrocarbon-Rezeptor (AHR) aktivieren, einen Hauptimmunregulator und Stoffwechselsensor, der eine immunsuppressive Mikroumgebung und Metastasierung fördert. Es wurde nachgewiesen, dass die Kyn-Signalweg-AHR-Achse eine entscheidende Rolle bei der Stoffwechselumprogrammierung spielt und das Überleben von Krebs, die Tumorprogression, die Metastasierung und die Etablierung einer immunsuppressiven Mikroumgebung unterstützt. Es wurde bereits beschrieben, dass es nach dem Knockdown von EWSR1::FLI1 zu einer Hochregulierung von TDO2 kommt, was zu höheren Kyn-Spiegeln und einer AHR-Kern-Translokation führt. Es gibt jedoch keine Berichte darüber, ob dieser Stoffwechselweg die Entstehung von EwS-Tumoren und das klinische Ergebnis beeinflusst. Durch die Analyse eines großen Transkriptom-Datensatzes von EwS-Patienten mit dazugehörigen klinischen Informationen und einer publizierten gewebeübergreifenden AHR-Aktivierungs-Signatur zeigte, dass eine hohe AHR- Aktivität mit einer schlechteren Gesamtüberlebensrate bei EwS-Patienten korreliert. Darüber hinaus zeigten funktionelle Experimente an EwS-Zelllinien unter Verwendung von RNA-Interferenz-vermitteltem Knockdown von EWSR1::ETS, dass eine verringerte EWSR1::ETS-Expression mit erhöhten TDO2- und IL4I1-Expressions- niveaus und folglich einer höheren Kyn-Produktion verbunden ist. Da EWSR1::ETS die Expression dieser Enzyme und die Kyn-Produktion zu unterdrücken schien, könnte eine Hochregulierung des Kyn-Signalwegs unter Bedingungen mit geringer EWSR1∷ETS-Expression möglicherweise die AHR-Signalübertragung erhöhen und zu dem EMT- und Metastasen-Phänotyp beitragen, der in EWSR1∷ETS- exprimierenden EwS-Zellen mit geringer Expression beobachtet wurde. Daher wurden EwS-Modelle mit induzierbarem shRNA-vermitteltem Knockdown von AHR generiert. Zellkulturbasierte Funktionsexperimente zeigten, dass das AHR-Silencing die Zellproliferation und die Klonogenität von EwS-Zelllinien in vitro signifikant verringert. Darüber hinaus reduzierte der AHR-Knockdown signifikant das Tumorwachstum in subkutanen Xenotransplantationsexperimenten sowie die Bildung von Metastasen in inneren Organen nach orthotopischer intraossärer Injektion von EwS-Zellen in immunkompromittierten Mäusen. Zusätzliche transkriptomische Signaturanalysen der EwS-Patientenkohorte zeigten, dass eine hohe AHR-Aktivität mit einer niedrigen EWSR1::ETS-Expression

korrelierte. Da AHR eine wichtige Rolle bei der Modulation des Immunsystems spielt, wurde untersucht, ob eine hohe AHR-Aktivierung zu dem immunologisch „kalten“ Phänotyp beitragen könnte, der bei EwS-Tumoren typischerweise beobachtet wird. Bei der Analyse der Kohorte von EwS-Patienten mit hoher AHR-Signalübertragung wurde eine signifikant erhöhte Infiltration von EwS-Tumoren mit immunsuppressiven Zellen (MDSCs, Tregs) festgestellt. Zell-Killing-Experimente mit der Natural Killer Zelllinie NK-92 ergaben, dass EWSR1::FLI1-high EwS-Zellen im Vergleich zu EWSR1::FLI1-low EwS-Zellen eine deutlich geringere Viabilität aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass EWSR1::FLI1-low EwS-Zellen vor der Abtötung durch NK-92- Zellen geschützt zu sein scheinen. Zusammenfassend liefert diese Arbeit weitere Belege für die Verknüpfung von EWSR1::ETS-Fusionen und dem Kyn-Signalweg und schlägt die AHR-Aktivität als vielversprechenden prognostischen Marker und potenzielles therapeutisches Ziel bei EwS vor. Da ein besseres Verständnis der metabolischen Landschaft bei EwS neue therapeutische Optionen hervorbringen könnte, könnte diese Arbeit einen wichtigen Schritt in diese Richtung darstellen.