German Title: Die Rolle von HIV-1 Nef in Antigen-Spezifischen Interaktionen von CD4 T-Zellen und Dendritischen Zellen

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Abstract

HIV-1 induced immunodeficiency is associated with severe impairment of both humoral and cellular adaptive immune responses that persists even under therapy. CD4 T cells, the main target cells for HIV-1 infection, execute important helper functions to both B and CD8 T cells in the context of antigen-specific immune responses, suggesting a connection between the functionality of CD4 T cells and adaptive immune dysfunction. A key step in generation of T cell help is antigen-specific interaction with DCs which activates and polarizes T cells towards a specialized effector phenotype, such as Tfh or Th1 cells, helping humoral or cellular immunity, respectively. Importantly, previous research demonstrated that HIV-1 directly interferes with CD4 T cell communication with B cells by action of the accessory Nef protein which impairs immune synapse (IS) function and thus, help to B cells, leading to B cell dysfunction in vivo. Concerning molecular architecture and dynamics, T cell IS formation with B cells is fundamentally different from T cell IS formation with DCs, the latter representing a crucial step in effector T helper cell generation and development of cellular immunity. Given the importance of T cell-DC interaction in determining the course of an immune response, I therefore aimed to investigate Nef’s role in CD4 T cell interaction with DCs in this study. By first using an antigen-specific mouse system in which Nef is expressed in CD4 T cells, I could demonstrate that Nef strongly interferes with early T cell-DC interaction dynamics and impairs effective activation of both CD4 T cells and DCs on a transcriptional and functional level ex vivo and in vivo. This dysfunction is in particular associated with inefficient Th1 polarization of CD4 T cells and establishment of a microenvironment which disfavors development of Th1 cells and cellular immunity. By using different Nef mutants together with a CRISPR/Cas9 KO approach, I could demonstrate that the inhibition exerted by Nef strongly depends on its CD4 downmodulation function, thus revealing an unknown role for this effector function in disruption of antigen-specific immune responses. In this context, I could observe that Nef had the capacity to limit CD4 T cell help to an antiviral CD8 T cell memory response in a preliminary LCMV infection experiment, suggesting Nef contributes to CD8 T cell dysfunction in vivo. In line with this, HIV-1 infection impaired CD4 T cell help to an EBVspecific memory CD8 T cell response in a complementary human ex vivo tonsil culture system for several, although not all donors with high variability. To mechanistically dissect adaptive immune cell interactions in the ex vivo tonsil culture system and to gain better understanding of the underlying variability, I lastly established a workflow that enables highly efficient and activation-neutral gene editing of tonsil CD4 T cells by CRISPR/Cas9 RNP nucleofection without affecting immunocompetency of the system. In summary, these findings provide evidence that HIV-1 Nef, by interfering with CD4 T cell interaction with and licensing of DCs, limits efficient CD4 T cell effector cell generation and in particular, Th1 responses in a murine cell context. As this was associated with suboptimal help to memory CD8 T cell responses in ex vivo human tonsil culture and in an in vivo LCMV infection model, Nef may in this way contribute to CD8 T cell dysfunction in the context of HIV infection. This study therefore identifies Nef as a global antagonist of adaptive immune responses and interesting viral therapeutic target.

Translation of abstract (German)

Die HIV-1 assoziierte Immunschwäche geht mit einer schweren Beeinträchtigung von humoralen und zellulären adaptiven Immunantworten einher die sogar unter Therapie bestehen bleiben. CD4 T-Zellen, die Hauptzielzellen für eine HIV-1 Infektion, üben wichtige Helferfunktionen zu B- und CD8 T-Zellen im Rahmen antigenspezifischer Immunantworten aus was einen Zusammenhang zwischen der Funktionalität der CD4 T-Zellen und adaptiven Immundysfunktion nahelegt. Ein wichtiger Schritt in der Generation von T-Zellhilfe ist die antigenspezifische Interaktion mit Dendritischen Zellen (DZ) die T-Zellen aktivieren und zu spezialisierten Effektor-Phänotypen polarisieren, wie z.B. Tfh oder Th1 Zellen die jeweils die humorale oder zelluläre Immunantwort unterstützen. Vorherige Forschung konnte demonstrieren, dass HIV-1 direkt die Kommunikation zwischen CD4 T-Zellen und B-Zellen mittels des akzessorischen Nef-Proteins stört, welches die Funktion der Immunsynapse (IS) und somit, Hilfe zu B-Zellen behindert was letztlich zu einer B-Zell Dysfunktion in vivo führt. Was die molekulare Architektur und Dynamik betrifft, unterscheidet sich die IS von T-Zellen mit BZellen fundamental von der IS zwischen T-Zellen und DZ wobei letztere einen entscheidenden Schritt in der Generierung von Effektor T-Helferzellen und Entwicklung zellulärer Immunität darstellt. Angesichts der Bedeutung der T-Zell-DZ Interaktion für den Verlauf einer Immunreaktion, wollte ich daher die Rolle von Nef in CD4 T-Zell Interaktionen mit DZ in dieser Studie untersuchen. Unter Verwendung eines antigenspezifischen Maus-Systems in welchem Nef in CD4 T-Zellen exprimiert wird, konnte ich zuerst demonstrieren, dass Nef stark die frühe T-Zell-DZ Interaktionsdynamik beeinträchtigt und die effektive Aktivierung von sowohl CD4 T-Zellen als auch DZ auf transkriptioneller und funktioneller Ebene ex vivo und in vivo behindert. Diese Dysfunktion ist insbesondere mit einer ineffizienten Th1 Polarisierung von CD4 T-Zellen und Etablierung einer Mikroumgebung assoziiert welche die Entwicklung von Th1 Zellen und die zelluläre Immunität beeinträchtigt. Durch Verwendung verschiedener Nef-Mutanten in Kombination mit einem CRISPR-Cas9 Ansatz konnte ich zeigen, dass die Inhibition durch Nef stark von dessen negativer Regulation von Oberflächen-CD4 abhängt was eine unbekannte Rolle dieser Effektorfunktion in der Beeinträchtigung antigenspezifischer Immunantworten offenbart. In diesem Zusammenhang konnte ich beobachten, dass Nef die Fähigkeit hatte, die CD4 T-Zellhilfe zu einer antiviralen CD8 T-Zell Gedächtnisantwort in einem präliminären LCMV Infektionsexperiment zu beeinträchtigen was darauf hindeutet, dass Nef zur CD8 T-Zell Dysfunktion in vivo beiträgt. In Übereinstimmung damit behinderte eine HIV-1 Infektion die CD4 T-Zellhilfe zu einer EBV-spezifischen Gedächtnis CD8 T-Zellantwort in einem komplementären humanen ex vivo Tonsillenkultursystem bei einigen, jedoch nicht allen Spendern mit hoher Variabilität. Um adaptive Immunzell-Interaktionen in der ex vivo Tonsillenkultur mechanistisch zu analysieren und um ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Variabilität zu erlangen habe ich letztlich einen Arbeitsablauf etabliert, der hocheffiziente und aktivierungsneutrale Gen-Editierung von tonsillären CD4 T-Zellen durch CRISPR-Cas9 RNP Nukleofektion ermöglicht ohne die Immunkompetenz des Systems zu beeinträchtigen. Zusammenfassend liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass HIV-1 Nef durch Beeinträchtigung der Interaktion von CD4 T-Zellen mit DZ und deren Lizensierung die effiziente Bildung von CD4 T-Effektorzellen und insbesondere, Th1-Zellen im murinen Zellkontext einschränkt. Da dies mit einer suboptimalen Hilfe zu Gedächtnis CD8 TZellantworten in der ex vivo humanen Tonsillenkultur und in einem in vivo LCMV Infektionsmodell assoziiert war, könnte Nef auf diese Weise zur CD8 T-Zell Dysfunktion im Kontext einer HIV Infektion beitragen. Diese Studie identifiziert Nef daher als einen globalen Antagonisten adaptiver Immunantworten und interessantes virales Therapieziel.