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Abstract

An estimated ~12 million people worldwide suffer from chronic hepatitis D virus (HDV) infection, which can cause the most aggressive form of viral hepatitis when co-infected with hepatitis B virus (HBV), leading to an accelerated process of liver dysfunction towards hepatic fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HDV is a satellite virus and relies on its helper HBV to provide HBV surface antigen (HBsAg) for viral assembly and subsequent secretion. Currently, the sole antiviral drug approved by the European Medicines Agency specifically for HDV treatment is the entry inhibitor bulevirtide, however, it is only available in certain European countries. Despite this significant burden, our knowledge of HDV biology remains limited, thus restricting the development of targeted antiviral therapies. This is partly due to the lack of reliable HDV cell culture systems that mimic the physiological status of hepatocytes in vivo. In this thesis, I have demonstrated the use of stem cell-derived hepatocyte-like cells (HLCs) as a novel cell culture model for the study of HDV. HLCs are fully susceptible to HDV infection across various tested genotypes. They endogenously express the cell entry receptor the sodium taurocholate co-transporting polypeptide at levels sufficient to mediate HBV/HDV entry. When co-infected with HBV or ectopically expressing HBsAg through adeno-associated virus transduction (HLCsHBsAg), HLCs are able to effectively produce and release infectious progeny virions, thus recapitulating the entire HDV life cycle. Using the HLCsHBsAg system, I also demonstrated that the system supports the extracellular spread of HDV, which occurs in vivo but has been so far challenging to replicate in vitro. This allowed me to test available anti-HDV regimens that target HDV spread, underscoring the utility of HLCs as a platform for drug candidate evaluation. By challenging the cells along the differentiation with HDV infection, I observed an increased susceptibility to HDV infection in fully matured HLCs. Using transcriptomic analysis and further confirmation studies, I identified CD63 as a novel HDV co-entry factor, which was found to be rate-limiting for HDV infection in immature hepatocytes. While this finding augments our understanding of HBV/HDV infection imminently, it also provides a guideline on how to use stem cell differentiation and stem cell-derived culture models to identify host factors of other viruses. To conclude, my study provides a comprehensive and quantitative assessment of HDV infection, showing that HLCs can recapitulate the entire HDV life cycle and support extracellular spread, as well as revealing the identification of novel host co-factor(s), such as the entry co-factor CD63. As an alternative to hepatoma cells and primary human hepatocytes, HLCs represent a renewable, physiologically relevant and genetically tractable system for HDV-host interaction studies and anti-viral drug evaluation.

Translation of abstract (German)

Weltweit leiden schätzungsweise 12 Millionen Menschen an einer chronischen Infektion mit dem Hepatitis D Virus (HDV), das bei einer Koinfektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) die aggressivste Form der Virushepatitis auslösen kann, was zu einem beschleunigten Prozess der Leberdysfunktion hin zu Leberfibrose, Zirrhose und Leberzellkarzinomen führt. HDV ist ein Satellitenvirus, da es vom Helfervirus HBV abhängt, welches das HBV-Oberflächenantigen (HBsAg) für die Assemblierung der viralen Komponenten und die anschließende Sekretion bereitstellt. Das einzige antivirale Medikament, das derzeit von der Europäischen Arzneimittelagentur speziell für die Behandlung von HDV zugelassen ist, ist der Eintrittsinhibitor Bulevirtide, der jedoch nur in bestimmten europäischen Ländern erhältlich ist. Zusätzlich dazu, ist das molekularbiologische Wissen über HDV sehr beschränkt, was die Entwicklung gezielter antiviraler Therapien behindert. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine zuverlässigen HDV-Zellkultursysteme gibt, die den physiologischen Zustand der Hepatozyten in vivo nachahmen. In dieser Arbeit habe ich die Verwendung von aus Stammzellen abgeleiteten hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs) als neuartiges Zellkulturmodell für die Untersuchung von HDV demonstriert. HLCs sind für eine HDV-Infektion mit verschiedenen Genotypen suszeptibel. Sie exprimieren endogen den Zelleintrittsrezeptor, das Natriumtaurocholat-Kotransportpolypeptid, in ausreichender Menge, um den Eintritt von HBV/HDV zu vermitteln. Bei Koinfektion mit HBV oder ektopischer Expression von HBsAg durch adeno-assoziierte Virustransduktion (HLCsHBsAg) sind HLCs in der Lage, infektiöse Nachkommen-Virionen zu produzieren und freizusetzen und damit den gesamten HDV-Lebenszyklus zu rekapitulieren. Mit dem HLCsHBsAg System konnte ich auch zeigen, dass das System die extrazelluläre Ausbreitung von HDV unterstützt, die in vivo auftritt, aber bisher nur schwer in vitro zu replizieren war. Dies ermöglichte es mir, verfügbare Anti-HDV-Therapien zu testen, die auf die Ausbreitung von HDV abzielen, was den Nutzen von HLCs als Plattform für die Bewertung von Arzneimittelkandidaten unterstreicht. Indem ich die Zellen während der Differenzierung mit einer HDV-Infektion infizierte, konnte ich eine erhöhte Anfälligkeit für HDV-Infektionen in voll ausgereiften HLCs beobachten. Unter anderem mit Hilfe von Transkriptomanalysen konnte ich CD63 als einen neuen HDV-Eintritts-Kofaktor identifizieren, der sich als limitierend für die HDV-Infektion in unreifen Hepatozyten erwies. Diese Ergebnisse erweitern nicht nur unser Verständnis der HBV/HDV-Infektion, sondern liefern auch einen Leitfaden für die Verwendung von Stammzelldifferenzierungs- und Stammzellkulturmodellen für die Identifizierung von Wirtsfaktoren, die für andere Viren eine wichtige Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Studie eine umfassende und quantitative Bewertung der HDV-Infektion ermöglicht. Sie zeigt, dass HLCs den gesamten HDV-Lebenszyklus rekapitulieren und die extrazelluläre Ausbreitung unterstützen können und dass neue Wirts-Cofaktoren, wie der Eintritts-Cofaktor CD63, identifiziert werden konnten. Als Alternative zu Hepatomazellen und primären menschlichen Hepatozyten stellen HLCs ein erneuerbares, physiologisch relevantes und genetisch vertretbares System für HDV-Wirt-Interaktionsstudien und die Bewertung antiviraler Arzneimittel dar.