PDF, English - main document Restricted access: Repository staff only until 2 March 2027. Login+Download (14MB) | Lizenz: Nuclear and cytosolic J-domain proteins Apj1, Sis1, and Ydj1 provide synergistic control of Hsf1 at distinct phases of the heat shock response by Svoboda, Lucia underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0

Abstract

The cellular protein quality control (PQC) system prevents the buildup of misfolded proteins by refolding, degrading, and sequestering them, thereby maintaining protein homeostasis, also known as proteostasis. The heat shock response (HSR) is a transcriptional mechanism that controls the expression of the stress response machinery, which protects eukaryotic cells from proteotoxic stress in both the cytosol and nucleus. The initiation and regulation of the response are mediated by stress-dependent control of heat shock transcription factors (HSFs). Saccharomyces cerevisiae encodes a single HSF (Hsf1), making it easier to study HSR regulation. Hsf1 is suppressed by Hsp70 chaperones under normal, nonstress conditions and becomes activated during proteotoxic stress, directly linking protein misfolding and its recovery to the HSR. J-domain proteins (JDPs) are crucial for targeting of Hsp70s to their substrates, yet the specific JDP(s) responsible for regulating Hsf1 and connecting protein damage to HSR activation and inactivation (attenuation) were unclear. In yeast, 22 JDP proteins exist, 11 of which are located in the cytosol and nucleus. They include the nuclear Apj1 and cytonuclear Ydj1 and Sis1. The class A JDP Apj1 is expressed in low copy numbers under non-stress conditions and disaggregates substrates within the intra-nuclear protein quality control compartment (INQ) during proteotoxic stress. The nuclear and cytosolic class B JDP Sis1 has been suggested as the main regulator of HSR induction, yet it is not implicated in HSR attenuation. Class A Ydj1 is the most abundant JDP in the yeast cytosol, and its deletion results in a strong proteostasis phenotype without inducing the HSR. In my doctoral thesis, I show that deletion of the gene encoding the yeast nuclear JDP Apj1 results in significantly impaired HSR attenuation. In apj1Δ cells, this leads to upregulation of heat shock protein expression, which is primarily controlled by Hsf1, after 60 minutes of continuous heat stress. Additionally, I see colocalization of Hsf1-GFP and Apj1-mScarlet during the HSR. ChIP-Seq data from our collaboration partners Dr. Fabian den Brave (University of Bonn) and Prof. David Gross (LSU Shreveport) showed that Apj1 interacts with DNA-bound Hsf1 during the attenuation of the HSR. The combined data show that Apj1 controls the attenuation phase of the HSR by promoting Hsf1’s displacement from heat shock elements in promoter regions. Apj1’s involvement in both nuclear PQC and Hsf1 regulation suggests a direct link between nuclear proteostasis and HSR regulation. Sis1 has been implicated in repressing V Hsf1 prior to stress. However, Sis1 depletion led to enhanced expression of only some Hsf1-controlled genes, arguing against a dominant role in repressing Hsf1 in non-stressed cells. Additionally, combined depletion of both Sis1 and Apj1 did not result in a greater impact on HSR induction or attenuation, suggesting that the two JDPs function at different stages of the HSR. The lack of a synergistic effect from the APJ1 SIS1 double mutant suggests that other JDPs are involved in Hsf1 regulation under non-stress conditions. In fact, depleting Ydj1 and Apj1 simultaneously induces a strong HSR, indicating that Ydj1 plays a key role as a JDP that suppresses Hsf1 in non-stressed cells. I tested the hypothesis that the strong HSR phenotype of Ydj1-Apj1-deficient mutant cells is due to Ydj1's major role in protein homeostasis, leading to Sis1 titration. Cells lacking Ydj1 experience a proteostasis defect, resulting in a temperature-sensitive growth phenotype, but surprisingly, the HSR is not activated in these cells. Depleting Apj1 alongside Ydj1 restores proteostasis and alleviates growth sensitivity in YDJ1 mutant cells by inducing HSR upregulation. This indicates that Apj1 prevents the adjustment of chaperone levels to compensate for proteostasis defects by repressing Hsf1 in the YDJ1 mutant strain. Transcription and translation of genes controlled by Hsf1 in the nonstressed APJ1 YDJ1 double mutant are similar to those during heat shock. At the same time, ribosome biogenesis is reduced in the APJ1 YDJ1 double mutant, pointing to an intertwined activation of heat shock genes and suppression of ribosome production. Misfolded proteins in the cytosol can be directed to the nucleus for degradation. I propose that Ydj1 regulates the HSR by transporting misfolded proteins into the nucleus, where Apj1 can detect them, thereby connecting cytosolic to nuclear proteostasis and HSR control. To summarize, I show that in yeast S. cerevisiae, three JDPs—Apj1, Sis1, and Ydj1— work together to regulate the Hsf1-dependent HSR. Sis1 and Ydj1 maintain proteostasis under non-stress conditions, while all three JDPs suppress Hsf1. A decline in proteostasis activates the HSR by titrating away JDPs. Ydj1 could link the proteostasis state of the nucleus to that of the cytosol, while Apj1 connects the shutdown of the HSR to the proteostasis state within the nucleus.

Translation of abstract (German)

Das zelluläre Proteinqualitätskontrollsystem (PQC) verhindert die Ansammlung löslicher fehlgefalteter Proteine, indem es sie neu faltet, abbaut oder sequestriert, um die Proteinhomöostase, auch Proteostase genannt, aufrechtzuerhalten. Die Hitzeschockantwort (HSR) ist ein Transkriptionsmechanismus, der die Expression von PQC-Komponenten steuert, welche eukaryotische Zellen sowohl im Zytosol als auch im Zellkern vor proteotoxischem Stress schützt. Die Initiierung und Regulation der Reaktion wird durch die stressabhängige Kontrolle von Hitzeschock- Transkriptionsfaktoren (HSFs) vermittelt. Saccharomyces cerevisiae kodiert nur einen HSF (Hsf1), was die Erforschung der HSR-Regulation erleichtert. Hsf1 wird unter normalen, stressfreien Bedingungen durch Hsp70-Chaperone reprimiert und wird während proteotoxischem Stresses aktiviert, wodurch die Fehlfaltung von Proteinen und ihre Wiederherstellung direkt mit der HSR in Verbindung gebracht werden. J-Domänen- Proteine (JDPs) sind entscheidend für die Substraterkennung von Hsp70s, doch die spezifischen JDPs, die für die Regulierung von Hsf1 und die Verknüpfung von Proteinschäden mit der HSR-Aktivierung verantwortlich sind, sind noch unklar. In Hefe gibt es 22 JDP-Proteine, von denen sich 11 im Zytosol und im Zellkern befinden. Dazu gehören das nukleäre Apj1 und die zytonukleären JDPs Ydj1 und Sis1. Das JDP Apj1 der Klasse A wird unter Nicht-Stressbedingungen in geringer Menge exprimiert und disaggregiert Substrate innerhalb des intranukleären Proteinqualitätskontrollkompartiments (INQ) während proteotoxischen Stresses. Das nukleäre und zytosolische JDP Sis1 der Klasse B wird als Hauptregulator der HSRInduktion angesehen, ist jedoch nicht an der HSR-Repression beteiligt. Ydj1 der Klasse A ist das am häufigsten vorkommende JDP im Zytosol von Hefe, und seine Deletion führt zu einem starken Proteostase-Phänotyp, ohne die HSR zu induzieren. In meiner Doktorarbeit zeige ich, dass die Deletion des Gens, das für das nukleäre JDP Apj1 der Hefe kodiert, zu einer signifikant beeinträchtigten HSR-Abschaltung führt. In apj1Δ-Zellen führt dies nach 60 Minuten kontinuierlichem Hitzestress zu einer Hochregulation der Translation von Hitzeschockgenen, die in erster Linie durch Hsf1 reguliert werden. Darüber hinaus beobachte ich während der HSR eine Kolokalisierung von Hsf1-GFP und Apj1-mScarlet. ChIP-Seq-Daten unserer Kooperationspartner Dr. Fabian den Brave (Universität Bonn) und Prof. David Gross (LSU Shreveport) zeigten, dass Apj1 während der Abschwächung der HSR mit DNA-gebundenem Hsf1 interagiert. Basierend auf den kombinierten Daten schlage ich vor, dass Apj1 hauptsächlich die VII Abschaltungssphase der HSR steuert, indem es die Entfernung von Hsf1 von den Hitzeschockelementen in Hsf1-Promotoren fördert. Die Beteiligung von Apj1 sowohl an der nukleären PQC als auch an der Hsf1-Regulierung deutet auf einen direkten Zusammenhang zwischen der nukleären Proteostase und der HSR-Regulierung hin. Sis1 ist an der Unterdrückung von Hsf1 vor Stress beteiligt. Die Depletion von Sis1 führte jedoch zu einer verstärkten Expression von nur einigen Hsf1- kontrollierten Genen, was gegen eine dominante Rolle bei der Unterdrückung von Hsf1 in nicht gestressten Zellen spricht. Darüber hinaus hatte die kombinierte Depletion von Sis1 und Apj1 keinen größeren Einfluss auf die HSR-Induktion oder -Abschwächung, was darauf hindeutet, dass die beiden JDPs in verschiedenen Stadien der HSR funktionieren. Das Fehlen eines synergistischen Effekts des APJ1-SIS1-Doppelmutanten deutet darauf hin, dass andere JDPs an der Hsf1-Regulierung unter nicht gestressten Bedingungen beteiligt sind. Tatsächlich induziert die gleichzeitige Depletion von Ydj1 und Apj1 eine starke HSR, was darauf hindeutet, dass Ydj1 eine Schlüsselrolle als JDP spielt, das Hsf1 in nicht gestressten Zellen unterdrückt. Ich habe die Hypothese getestet, dass der starke HSR-Phänotyp von Ydj1-Apj1- defizienten Mutantenzellen auf die wichtige Rolle von Ydj1 bei der Proteinhomöostase zurückzuführen ist, was zu einer Titration von Sis1 führt. Zellen, denen Ydj1 fehlt, weisen einen Proteostase-Defekt auf, was zu einem temperaturempfindlichen Wachstumsphänotyp führt. Die HSR wird in diesen Zellen jedoch nicht aktiviert. Die Depletion von Apj1 zusammen mit Ydj1 stellt die Proteostase wieder her und mildert die Wachstumssensitivität in YDJ1-Mutantenzellen, indem sie eine Hochregulation der HSR induziert. Die Transkription und Translation von Genen, die durch Hsf1 im APJ1-YDJ1- Doppelmutanten kontrolliert werden, ähneln jenen während eines Hitzeschocks. Gleichzeitig ist die Ribosomenbiogenese im APJ1-YDJ1-Doppelmutanten reduziert, was auf eine miteinander verflochtene Aktivierung von Hitzeschockgenen und eine Unterdrückung der Ribosomenproduktion hindeutet. Missgefaltete Proteine im Zytosol können zum Abbau in den Zellkern transportiert werden. Ich schlage vor, dass Ydj1 die HSR reguliert, indem es missgefaltete Proteine in den Zellkern transportiert, wo Apj1 sie erkennen kann, wodurch die Proteostase im Zytosol mit der Proteostase im Zellkern und der HSR-Kontrolle verbunden wird. Zusammenfassend zeige ich, dass in der Hefe S. cerevisiae drei JDPs – Apj1, Sis1 und Ydj1 – zusammenarbeiten, um die Hsf1-abhängige HSR zu regulieren. Sis1 und Ydj1 erhalten die Proteostase unter Nicht-Stressbedingungen aufrecht, während alle drei JDPs Hsf1 unterdrücken. Eine Verschlechterung der Proteostase aktiviert die HSR, indem JDPs titriert werden. Ydj1 verbindet den Proteostasestatus des Zellkerns mit dem VIII des Zytosols, während Apj1 die Abschaltung der HSR mit dem Proteostasestatus innerhalb des Zellkerns verbindet.