German Title: Die funktionelle Relevanz der Adenin-mRNA-Methylierung für die Progression von Blasenkrebs

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Abstract

Urothelial carcinoma of the bladder (UCB) presents a major health challenge, and increasing evidence indicates that epitranscriptomic reprogramming contributes to tumor development. N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant internal modification in mammalian mRNA and regulates transcripts across the mRNA life cycle. The mark is installed by the m6A writer complex, in which METTL3 serves as the catalytically active component. Although METTL3 has been implicated in many cancers, its role in UCB remains controversial, and quantitative, high-resolution maps of m6A are lacking. Thus, this study aimed to reevaluate the role of METTL3 in UCB and to generate the first quantitative, base-resolution map of m6A in cancer, thereby resolving the mechanisms underlying malignant epitranscriptomic reprogramming. METTL3 knockout and inhibition impaired the oncogenic phenotype and global m6A levels in UCB cells. A complete loss of METTL3 could not be achieved due to the selection of cells expressing aberrant METTL3 isoforms. Dependency analyses and inhibitor response assays indicated that both UCB and uroepithelial cells require METTL3 for viability. Clinically, METTL3 is upregulated in UCB. However, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analyses of patient tissues found a global decrease in m6A, emphasizing the need for rigorous m6A mapping to resolve this contradiction. Accordingly, GLORI-seq was implemented to compare UCB with paratumoral tissue and showed systematic changes in the m6A profile of UCB. Two central m6A signatures were identified: a global methylation dilution driven by the upregulation of unmethylated transcripts and the downregulation of highly methylated transcripts. Conversely, differential methylation analyses found local stop-codon-proximal hypermethylation associated with an upregulation of the m6A writer complex component VIRMA. VIRMA knockdown reduced stop-codon-proximal m6A levels and impaired the oncogenic phenotype of UCB cells, suggesting a functional role for VIRMA in UCB development. Taken together, this study suggests a narrow therapeutic window for systemic METTL3 inhibition in UCB due to its essential character. However, the systematic alterations of the UCB m6A profile emphasize the diagnostic potential of m6A profiling. Finally, this work also provides first insights into the mechanisms that drive m6A epitranscriptomic reprogramming in cancer.

Translation of abstract (German)

Urotheliale Karzinome der Harnblase (UCB) stellen eine große gesundheitliche Herausforderung dar, und wachsende Evidenz zeigt, dass epitranskriptomische Reprogrammierung zur Tumorentstehung beiträgt. N6-Methyladenosin (m6A) ist die häufigste interne Modifikation in Säuger-mRNA und reguliert Transkripte während des gesamten mRNA-Lebenszyklus. Die Modifikation wird durch den m6A-Schreibkomplex installiert, in dem METTL3 die katalytisch aktive Komponente darstellt. Obwohl METTL3 in vielen Krebsarten eine Rolle spielt, bleibt seine Funktion im UCB umstritten. Zudem fehlen quantitative, hochauflösende m6A-Karten. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Rolle von METTL3 in UCB neu zu bewerten und die erste quantitative, basen-genaue m6A-Karte in Krebs zu erstellen, um die Mechanismen der malignen epitranskriptomischen Reprogrammierung aufzuklären. Der Knockout von METTL3 sowie dessen Inhibition reduzierten den onkogenen Phänotyp und die globalen m6A-Level in UCB-Zellen. Ein vollständiger Verlust von METTL3 wurde jedoch nicht erreicht, da Zellen mit aberranten METTL3-Isoformen selektiert wurden. Abhängigkeitsanalysen und Inhibitor-Antworttests zeigten, dass sowohl UCB als auch uroepitheliale Zellen für ihre Viabilität auf METTL3 angewiesen sind. Klinisch ist METTL3 im UCB hochreguliert. Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analysen (LC-MS/MS) von Patientengeweben ergaben jedoch eine globale Reduktion von m6A, was die Notwendigkeit rigoroser m6A-Kartierungen zur Klärung dieses Widerspruchs unterstreicht. Entsprechend wurde GLORI-seq implementiert, um UCB mit paratumoralem Gewebe zu vergleichen. Es zeigten sich systematische Veränderungen im m6A-Profil des UCB. Zwei zentrale m6A Signaturen wurden identifiziert: Eine globale Methylierungsverdünnung, bedingt durch die Hochregulation unmethylierter Transkripte und die Herunterregulation stark methylierter Transkripte. Im Gegensatz dazu identifizierten Differentialmethylierungsanalysen eine lokale Stopcodon-nahe Hypermethylierung, die mit einer Hochregulation der m6A-Schreibkomplex-Komponente VIRMA verknüpft war. Der Knockdown von VIRMA verringerte die Methylierungslevel an den Stopcodons und schwächte den onkogenen Phänotyp von UCB-Zellen, was auf eine funktionelle Rolle für VIRMA in der Entwicklung von UCB hinweist. Zusammengefasst deutet diese Studie aufgrund des essenziellen Charakters von METTL3 auf ein enges therapeutisches Fenster für eine systemische METTL3-Inhibition im UCB hin. Die systematischen Veränderungen des m6A-Profils im UCB betonen jedoch das diagnostische Potenzial des m6A-Profilings. Abschließend liefert diese Arbeit erste Einblicke in die Mechanismen, die die epitranskriptomische Reprogrammierung von m6A in Krebs antreiben.