German Title: Charakterisierung von N6-Methyladenosin und N4-Acetylcytidin auf humanen centromerischen RNAs

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Abstract

Centromeres are essential chromosomal regions that ensure accurate chromosome segregation during cell division by serving as the assembly platform for the kinetochore. Most centromeres are epigenetically defined by the histone H3 variant CENP-A, are composed of highly repetitive DNA, and are embedded within pericentromeric heterochromatin. Despite this transcriptionally repressive environment, centromeres are actively transcribed, producing centromeric RNAs (cenRNAs). These transcripts have been shown to be vital for maintaining centromere integrity, facilitating CENP-A deposition, and promoting the formation of pericentromeric heterochromatin. Because both excess and deficiency in cenRNA levels can disrupt centromere function, their expression must be precisely regulated. However, the mechanisms underlying cenRNA function and regulation remain poorly understood. RNA modifications represent a rapidly evolving field of research, as they are involved in all aspects in the life of an RNA, including RNA-protein interactions, RNA stability and translation. However, so far they were mostly studied in context of tRNAs, rRNAs and mRNAs but only little is known about their existence on repetitive RNAs including cenRNAs. In this thesis, I study the presence and function of RNA modifications on human cenRNA and their role for centromere integrity and pericentromeric heterochromatin formation. Using a bioinformatic approach reanalysing a plethora of published Next-Generation-Sequencing datasets addressing RNA modifications, I identified N6-methyladenosine (m6A) and N4-acetylcytidine (ac4C) on cenRNA. The findings of this thesis indicate that α-satellite RNA is a selectively m6A-modified centromeric transcript subject to dynamic regulation and likely exists in distinct subpopulations characterized by differences in subcellular localization and polyadenylation status. These observations further suggest that m6A modification may play a critical role in modulating cenRNA turnover and maintaining centromere homeostasis—processes that could be disrupted in the context of cancer. Furthermore, this thesis uncovers (peri-)centromeric RNAs as an exceptional target of NAT10 mediated RNA acetylation. By integrating bioinformatics, biochemical validation, and cross-species functional assays, I determined an essential and conserved role for NAT10 in pericentromeric heterochromatin formation but also as a central regulator of the global chromatin landscape. These findings significantly extend our understanding of epitranscriptomic regulation of cenRNAs but also establish a strong foundation for future research linking RNA modifications to chromatin & centromere biology.

Translation of abstract (German)

Centromere sind zentrale Strukturen der Chromosomen, die während der Zellteilung für eine präzise Verteilung des Erbmaterials sorgen. Sie dienen als Plattform für den Aufbau des Kinetochors – eines Proteinkomplexes, der die Chromosomen mit den Spindelfasern verbindet. Die meisten Centromere sind epigenetisch durch die Histon-H3-Variante CENP-A definiert, bestehen aus hochrepetitiver DNA und sind in eine heterochromatische, transkriptionshemmende Umgebung eingebettet. Trotz dieser repressiven Chromatinstruktur werden Centromere aktiv transkribiert und produzieren centromerische RNAs (cenRNAs). Diese spielen eine zentrale Rolle für die Stabilität des Centromers, die korrekte Einlagerung von CENP-A und die Bildung pericentromerischen Heterochromatins. Da sowohl ein Übermaß als auch ein Mangel an cenRNAs die Centromerfunktion empfindlich stören kann, bedarf ihre Expression einer besonders feinen Regulation. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bislang jedoch nur unzureichend verstanden. RNA-Modifikationen sind ein dynamisches und zunehmend erforschtes Gebiet, da sie nahezu alle Aspekte des RNA-Stoffwechsels beeinflussen – von der Stabilität und Translation bis hin zur Wechselwirkung mit Proteinen. Während diese Modifikationen bisher vor allem bei tRNAs, rRNAs und mRNAs untersucht wurden, ist über ihre Rolle bei repetitiven RNAs – wie etwa cenRNAs – bislang wenig bekannt. In dieser Dissertation untersuche ich das Vorkommen und die funktionelle Bedeutung von RNA-Modifikationen auf menschlichen cenRNAs und ihre Rolle für die Integrität des Centromers und die Ausbildung pericentromerischen Heterochromatins. Mithilfe bioinformatischer Reanalysen zahlreicher publizierter Next-Generation-Sequencing-Datensätze konnte ich zwei Modifikationen auf cenRNAs identifizieren: N6-Methyladenosin (m6A) und N4-Acetylcytidin (ac4C). Die Ergebnisse legen nahe, dass α-Satelliten-RNAs selektiv mit m6A modifiziert werden und in unterschiedlichen Subpopulationen vorliegen, die sich in ihrer subzellulären Lokalisation und ihrem Polyadenylierungsstatus unterscheiden. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass m6A eine zentrale Rolle im Abbau und der Homöostase centromerischer RNAs spielt – Prozesse, die möglicherweise bei Krebserkrankungen gestört sind. Darüber hinaus zeigt die Arbeit, dass (peri-)centromerische RNAs ein bisher unbekanntes Ziel der durch NAT10 vermittelten RNA-Acetylierung darstellen. Durch die Kombination aus bioinformatischer Analyse, biochemischer Validierung und funktionellen Experimenten in verschiedenen Modellsystemen konnte ich eine essentielle, evolutionär konservierte Rolle von NAT10 sowohl in der pericentromerischen Heterochromatinbildung als auch in der übergeordneten Regulation der chromatinbasierten Genomorganisation nachweisen. Diese Arbeit erweitert unser Verständnis der epitranskriptomischen Kontrolle centromerischer RNAs und schafft eine wichtige Grundlage für zukünftige Forschungen zur Rolle von RNA-Modifikationen in der Chromatin- und Centromerbiologie.