English Title: Peptide membranes from de novo designed helix-loop-helix peptides

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Abstract

Obwohl Liposomen in den letzten Jahrzehnten unter anderem für den Transport von Pharmazeutika und den Aufbau künstlicher Zellen genutzt wurden, ist ihre Synthese komplex und die breite, kostengünstige Anwendung eingeschränkt. Künstliche, auf Peptiden basierende Membranen bieten Vorteile im Hinblick auf die Einfachheit ihrer Synthese, der Vielfalt an chemisch modifizierbaren Bausteinen und der Fülle an möglichen Morphologien mit hoher Stabilität. Damit einher geht eine bessere Anpassungsfähigkeit an spezifische Anwendungen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erweiterung des Feldes der amphiphilen Peptide um einen komplexen Baustein in Form des Helix-Loop-Helix-Motivs. Dieses Motiv umfasst zwei hydrophobe α-helikale Segmente, die durch eine hydrophile Schleife verbunden sind und wurde herangezogen, um die Designlimitierungen, vor allem linearer amphiphiler Peptide, zu umgehen. Die Synthese einer Bibliothek an Helix-Loop-Helix (HLH)-Peptiden erlaubte zudem die Analyse von Sequenz-Funktion-Beziehungen.

Es wurden repetitive Sequenzen hydrophober Aminosäuren zum Aufbau der Helixarme genutzt, während die hydrophilen Segmente aus Glycin, Prolin und verschiedenen positiv geladenen Aminosäuren aufgebaut wurden. Varianten der HLH-Peptide mit jeweils neun Alanin-Einheiten in den hydrophoben Segmenten bildeten keine stabilen dreidimensionalen Strukturen. Hingegen gelang eine erfolgreiche Selbstassemblierung in sphärische Peptidpartikel aus ethanolischer Lösung durch die Verwendung von Leucinresten in den hydrophoben Segmenten. Eine umfassende Charakterisierung der vierfach positiv-geladenen Stammverbindung HLHP4 zeigte die Bildung diskreter Partikel mit Durchmessern von unter 100 nm mit α-helikaler Sekundärstruktur. Darüber hinaus wiesen die Partikel unter den richtigen Lagerungsbedingungen eine sehr gute Langzeitstabilität auf. Interessant war die Beobachtung einer temperaturinduzierten, irreversiblen Umwandlung zur β-Faltblatt-Sekundärstruktur bei Temperaturen um 50 °C. Basierend auf diesen Beobachtungen konnte HLHP4 ebenfalls gezielt in Partikel mit β-Faltblatt-Sekundärstruktur assembliert werden, die sich von den α-helikalen Konformeren in den Eigenschaften unterschieden und beispielsweise Partikelfusion eingingen.

Unter der Verwendung α-helikaler Peptidpartikel von HLHP4 konnte die Existenz einer hydrophoben Umgebung in den Partikeln mit umgebungssensitiven Farbstoffen und die erfolgreiche Enkapsulierung und Retention von Amplex® Red nachgewiesen werden. Die Gruppe an Leucin-haltigen Peptiden wurde um HLHP5 und HLHP6 erweitert, die sich in der Zusammensetzung der hydrophilen Schleife unterschieden. In HLHP5 wurden vier Argininreste durch Lysine ersetzt und die Länge der Schleife im Vergleich zu HLHP4 konstant gehalten. In HLHP6 wurde die hydrophile Region um eine Einheit verlängert und insgesamt fünf Argininreste verwendet. Dabei konnten sequenzabhängige Unterschiede zwischen den Peptidpartikeln beobachtet werden. HLHP4 war dabei am stabilsten.

Translation of abstract (English)

Although liposomes are used for decades in drug delivery applications or construction of artificial cells, their synthesis is complex and they lack broad and economical applicability. Artificial peptide-based membranes offer many advantages over lipids, e.g. established and easy chemical synthesis, high number of chemically modifiable building blocks and a plethora of possible morphologies with high stability. All these factors enable a better tunability to specific applications.

The aim of this project was to expand the field of amphiphilic peptides by using the helix-loop-helix motif. This building block comprises two hydrophobic segments, which are connected by a hydrophilic loop. The higher complexity of this motif in comparison to linear amphiphilic peptides allows to circumvent their design limitations. The synthesis of a small library of helix-loop-helix (HLH) peptides shed light onto sequence-function-relationships of this class of peptides.

Both helical arms incorporated a repetitive sequence of hydrophobic amino acids. The hydrophilic segments encompassed glycine, proline and different positively charged residues. Variations of the HLH peptides incorporating nine alanine residues per hydrophobic area did not form stable three-dimensional structures. However, utilizing peptides with nine leucine residues per hydrophobic segment led to successful self-assembly into spherical particles starting from an ethanolic peptide solution. An extensive characterization of the first, fourfold positively charged variant HLHP4 proved the formation of discrete particles with sub 100 nm diameters and α-helical secondary structure. These particles also exhibited excellent long-term stability under the right storage conditions. Most interestingly, an irreversible temperature induced transformation of secondary structure to β-sheet was observed at temperatures around 50 °C. Based on these results a straightforward preparation method for β-sheet HLHP4 was found. These conformers showed different properties than the α-helical counterparts and underwent particle fusion.

The hydrophobic environment of the α-helical particles of HLHP4 was successfully probed with environmental-sensitive dyes and the ability to encapsulate and retain Amplex® Red was shown as well. The group of leucin-rich HLH peptides was expanded by synthesizing HLHP5 and HLHP6, which both displayed different loop compositions. In HLHP5 four arginine residues were exchanged for lysine resulting in identical loop length compared to HLHP4. The hydrophilic segment was extended by one unit in HLHP6 incorporating five arginine residues. The characterization of these peptides revealed sequence-dependent differences in the characteristics of the peptide particles with HLHP4 being the most stable.