German Title: Charakterisierung von Zellen aus Mikrotieknorpel und dessen Perichondrium für die autologe Rekonstruktion der menschlichen Ohrmuschel in Tissue-Engineering Ansätzen

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Abstract

Mikrotie, eine angeborene Anomalie des äußeren Ohrs, umfasst ein Spektrum von Phänotypen, das von einer leichten Deformierung mit einer kleineren Ohrmuschel bis zum vollständigen Fehlen des äußeren Ohrs (Anotie) reicht. Dies führt zu psychosozialen Belastungen wie Depressionen oder sozialem Rückzug. Eine Rekonstruktion des fehlgebildeten Ohrs kann die Lebensqualität von Mikrotie-Patienten verbessern. Der derzeitige Goldstandard der Mikrotie-Behandlung ist die autologe Rekonstruktion, bei der Knorpeltransplantate aus der Rippe verwendet werden, um eine Ohrmuschel zu bilden. Das Verfahren ist jedoch äußerst anspruchsvoll, und das Ergebnis hängt von verschiedenen Faktoren ab, z. B. von den Fähigkeiten des Chirurgen oder der Menge des verfügbaren Rippenknorpels. Es können auch Komplikationen auftreten, wie Hebedefekt-Morbiditäten e, sichtbare Brustdeformitäten oder Pneumothorax und postoperative Infektionen an beiden Operationsstellen. Tissue Engineering (TE)-Technologien bieten neue Möglichkeiten für die Behandlung der Mikrotie, da sie die Herstellung von Knorpelgewebe in vitro unter Verwendung körpereigener Zellen und Biomaterialien ermöglichen. Ohrknorpel und sein Perichondrium wurden als autologe Zellquelle für TE-Anwendungen bei Mikrotiepatienten in Betracht gezogen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Zellen aus dem Perichondrium und Knorpelgewebe von Mikrotie-Patienten zu charakterisieren und ihre Eignung für TE-Ansätze zur autologen Ohrmuschelrekonstruktion zu testen.

Zu diesem Zweck wurden die Zellen zunächst durch zwei verschiedene Isolierungsmethoden (enzymatischer Verdau und Auswuchskultur) isoliert und die Bedingungen für die Zellkultur optimiert. Anschließend wurden verschiedene Eigenschaften der Vorläuferzellen untersucht, wie z. B. die Adhäsion an Kunststoff, die Migrationsfähigkeit und die Selbsterneuerung (Koloniebildung). Getestet wurde die Migrationsfähigkeit und die Fähigkeit Kolonien zu bilden. Zur weiteren Zellcharakterisierung wurde die Expression von Oberflächenmarkern, die für chondrogene Vorläuferzellen spezifisch sind, mittels Durchflusszytometrie analysiert und eine Genexpressionsanalyse knorpelspezifischer Proteine mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Von besonderem Interesse waren dabei Aggrecan, Elastin, Kollagen I, Kollagen II und Sox9. Darüber hinaus wurden die isolierten Zellen auf ihr Verhalten in 3D-Zellkulturmodellen (Sphäroide und ein Hydrogel-basiertes Modell) untersucht. Die Ergebnisse meiner Studie zeigen, dass Perichondrozyten von Mikrotiepatienten mit Hilfe einer Auswuchskultur erfolgreicher isoliert werden können als durch enzymatischen Verdau. Die isolierten Zellen zeigen vorläuferähnliche Eigenschaften wie Migration und Koloniebildung, die mit denen gesunder Perichondrozyten und gesunder und Mikrotie Chondrozyten vergleichbar sind. Mikrotie-Perichondrozyten exprimierten alle untersuchten MSC-Oberflächenmarker, mit Ausnahme von CD146, in hohem Maße und im gleichen Ausmaß wie die verglichenen Zelltypen. Auch CD146 wurde bei den verglichenen Zelltypen nicht stark exprimiert. Im Hinblick auf die Genexpression knorpelspezifischer Gene wurde beobachtet, dass Mikrotie Perichondrozyten Elastin und Aggrecan exprimierten, nicht jedoch Kollagen II, was mit den anderen Zelltypen vergleichbar war. Kollagen I wurde in Mikrotie Perichondrozyten stärker exprimiert als in den anderen Zelltypen.

In den durchgeführten dreidimensionalen Zellkulturmodellen zeigten histologische und immunhistochemische Analysen auch die Expression knorpelspezifischer Proteine nach fünf Wochen in Kultur. Die Expression von Kollagen II wurde ebenfalls in allen Zelltypen in beiden 3D-Modellen nachgewiesen.

Dies deutet darauf hin, dass Perichondrozyten von Mikrotiepatienten ein Potenzial für die autologe Rekonstruktion aufweisen. Außerdem deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Perichondrozyten von Mikrotiepatienten in Hydrogelkonstrukten verwendet werden können.

Die Ergebnisse von Zucchelli et al. zeigten, dass Zellen von Mikrotie-Patienten in 3D-Zellkultur wieder zu Verformungen führen können. In meiner Arbeit konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden. Daher sind weitere Studien mit einer größeren Anzahl von Spendern erforderlich, um festzustellen, ob das von Zucchelli beobachtete Phänomen spenderspezifisch oder mikrotiebezogen ist. Außerdem sollte vor dem klinischen Einsatz ein geeignetes 3D-Modell zur Vorhersage der klinischen Anwendbarkeit entwickelt werden.

Translation of abstract (English)

Microtia, a congenital anomaly of the external ear, covers a spectrum of phenotypes ranging from mild deformity with a smaller pinna to the complete absence of the external ear (anotia). This leads to psychosocial stress such as depression or social withdrawal. A reconstruction of the malformed ear can improve the quality of life of microtia patients. The current gold standard of microtia treatment is autologous reconstruction, in which cartilage grafts from the rib are used to form an auricle. However, the procedure is extremely challenging, and the outcome may vary depending on various factors such as the skill of the surgeon or the amount of available rib cartilage. Adverse effects may also occur, such as donor site morbidity or visible breast deformity, or even pneumothorax and postoperative infections at both surgical sites. TE technologies offer new opportunities for the treatment of microtia as they enable the production of cartilage tissue implants in vitro using autologous cells and biomaterials. The remnant of auricular cartilage and its perichondrium in microtia has been considered as an autologous cell source for tissue engineering applications. The present work aimed to characterize cells from the perichondrium and cartilage tissue of microtia patients and test their suitability for TE approaches for autologous auricular reconstruction. To this purpose, the cells were first isolated by two different isolation methods (enzymatic digestion and outgrowth culture) and the conditions for cell culture were optimised. Subsequently, various properties of progenitor cells were examined, such as adhesion to plastic, migratory capacity and self-renewal (colony formation). The ability to migrate and to form colonies was tested. For further cell characterization, the expression of surface marker specific for chondrogenic progenitor cells were analysed by flow cytometry, and a gene expression analysis of cartilage-specific proteins was performed using quantitative polymerase chain reaction. Of particular interest here were aggrecan, elastin, collagen I, collagen II and Sox9. Furthermore, isolated cells were investigated for their behaviour in 3D cell culture models (spheroids and a hydrogel-based model). The results of my study show that perichondrocytes can be more successfully isolated from microtia patients using an outgrowth culture than enzymatic digestion. Isolated cells exhibit progenitor-like properties such as migration and colony formation comparable to healthy perichondrocytes and healthy and microtia chondrocytes. Microtia perichondrocytes expressed all MSC surface markers analyzed, except for CD146, at high levels and to the same extent as the compared cell types. CD146 was also not strongly expressed in the compared cell types. With regard to gene expression of cartilage-specific genes, it was observed that microtia perichondrocytes expressed elastin and aggrecan, but not collagen II, which was comparable to the other cell types. Collagen I was expressed higher in microtia perichondrocytes than in the other cell types. In the three-dimensional cell culture systems that were performed, histological and immunohistochemical analyses also showed the expression of cartilage-specific proteins after only five weeks in culture. The expression of collagen II was also detected in all cell types in both 3D models. This suggests that perichondrocytes from microtia patients show potential for autologous reconstruction. Furthermore, these results suggest that microtia perichondrocytes can be used in hydrogel constructs. The results of Zucchelli et al. showed that cells from microtia patients in 3D cell culture can lead to deformation again. In my work, this effect could not be observed. Therefore, further studies with larger numbers of donors are needed to determine if the phenomenon observed by Zuchelli is donor specific or microtia related. Furthermore, a suitable 3D model to predict clinical applicability should be developed prior to clinical use.