German Title: Strukturelle Studien des Pleckstrinproteins mithilfe der Kernresonanzspektroskopie

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Abstract

Das Pleckstrinprotein ist das Hauptsubstrat von Protein Kinase C (PKC) in Blutplättchenzellen. Die Phosphorylierung Pleckstrins setzt Prozesse in Gang, die zur Aktivierung des Blutplättchens, Blutgerinnung und Wundverschluss führen. Pleckstrin besteht aus drei Domänen: den prototypischen pleckstrin homology (PH)-Domänen an den Termini des Proteins sowie einer zentralen DEP-Domäne. Die Phosphorylierungsstellen für PKC liegen in der Verbindungssequenz zwischen der N-terminalen PH-Domäne (N-PH) und DEP. Die Strukturen dieser beiden Domänen sind (als Einzeldomänen) bereits bekannt. Im ersten Teil dieser Dissertation wird die mittels der Kernresonanzspektroskopie (NMR) berechnete hochaufgelöste Struktur der C-terminalen PH-Domäne (C-PH) vorgestellt. Durch biochemische und NMR-Analyse wurde eine spezifische Bindung C-PHs an Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphat (PtdIns(3,4)P2), einem wichtigen Botenstoff im Blutplättchen, nachgewiesen. Die Interaktion zwischen C-PH und PtdIns(3,4)P2 beruht auf einem konservierten Sequenzmotiv auf den beta1- und beta2-Strängen der Domäne und auf Sequenzdeterminanten in der beta1-beta2-Schleife. Diese Reste bilden eine positiv geladene Bindungstasche an der �offenen� Seite der Domäne. Die spezifische Bindung an PtdIns(3,4)P2 deutet erstmals auf eine mögliche zweite Regulationsebene Pleckstrins neben PKC-Phosphorylierung hin. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden das Doppeldomänenkonstrukt DEP_C-PH mit NMR und biochemischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche lassen darauf schließen, dass C-PH in DEP_C-PH einen unabhängigen PtdIns(3,4)P2-Sensor darstellt. Im letzten Teil dieser Dissertation wurde eine neue Strategie zur NMR-Strukturbestimmung von Multidomänenproteinen methodisch ausgearbeitet und auf Pleckstrin-Doppeldomänenkonstrukte angewandt. Die Methode beinhaltet die systematische Mutation aller nativen Cysteine zwecks Derivatisierung des Proteins mit einem �Spin-label� an eigens dafür eingeführten Cysteinen. Die vom �Spin-label� verursachte paramagnetische Relaxationsverstärkung wurde als �distance restraint� (Abstandsschranke) mittels interner Kalibrierung in Strukturrechnungen eingesetzt. Die auf diese Weise berechnete vorläufige Struktur von N-PH_DEP zeigt, dass die beiden Domänen dieses Proteins räumlich eng aneinander angelagert sind, was eine Blockierung der funktionalen Regionen von N-PH zur Folge haben könnte. Daher wird ein Auto-Inhibitions-Modell für unphosphoryliertes Pleckstrin vorgeschlagen.

Translation of abstract (English)

The pleckstrin protein is the major protein kinase C (PKC) substrate in blood platelets. Its phosphorylation triggers processes that ultimately lead to platelet activation which initiates blood clotting and wound closure. Pleckstrin consists of three domains: the prototypic pleckstrin homology (PH) domains at each terminus and a central DEP domain. The three PKC phosphorylation sites all lie in the linker sequence between the N-terminal PH domain (N-PH) and DEP. The structures of both N-PH and DEP have been previously solved. In the first part of this thesis, the novel high-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) structure of pleckstrin�s C-terminal PH (C-PH) domain is presented. By biochemical and NMR analysis, C-PH is found to bind specifically to phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate (PtdIns(3,4)P2), an important lipid second messenger in platelets. The interaction between C-PH and PtdIns(3,4)P2 involves conserved motifs on the beta1 and beta2 strands as well as determinants in the beta1−beta2 loop which form a basic patch at the �open� side of the PH domain. Thus, C-PH may play an important role in a control mechanism in addition to PKC phosphorylation that directly regulates pleckstrin�s activity and/or localisation in response to PtdIns(3,4)P2. In the second part of this work, the DEP_C-PH double-domain construct is studied by NMR and the phosphoinositide binding properties of all pleckstrin domains and constructs are analysed biochemically. Based on these data, C-PH appears to be a sensor for PtdIns(3,4)P2 that is independent of the remainder of the molecule. In the last part of this thesis a new strategy to obtain medium- to high-resolution structures of multi-domain proteins by NMR is developed and applied to pleckstrin double-domain constructs, involving a systematic mutagenesis scheme and site-directed spin-labelling. Methods for calibrating restraints derived from paramagnetic relaxation enhancement (PRE) caused by the spin-labels are implemented in a structure calculation of the pleckstrin N-PH_DEP double-domain construct. The preliminary structure of N-PH_DEP shows that the two domains are closely associated, which may obstruct the functional regions of N-PH. Thus, an �auto-inhibition� model of unphosphorylated pleckstrin is proposed.