German Title: Funktionelle Analyse von Sec61beta, ein Bestandteil des Sec61-Proteintranslokationskanal am endoplasmatischen Retikulum

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Abstract

Der Sec61-Komplex vermittelt über eine wäßrige Pore die Translokation von sekretorischen Proteinen ins ER-Lumen sowie die Insertion von Membranproteinen in die ER-Membran. Der Komplex besteht aus einer a-Untereinheit, die den eigentlichen Translokationskanal bildet, sowie einer b- und einer g-Untereinheit, die mit dem Kanal assoziiert sind. Die vorliegende Untersuchung zielt auf die Analyse der Funktion von Sec61b in Drosophila sowie die Charakterisierung der Sec61b Phosphorylierung. Keimbahnklone mit dem Funktionsverlust-Allel sec61bP1 besitzen kein Sec61b_in den Oocyten. Die sich aus diesen Oocyten entwickelnden Embryonen zeigen Störungen der dorso-ventralen Polarität, die auf Veränderungen der Proteinmenge und lokalisation von Gurken, einem EGF-Rezeptor Liganden, hinweisen. Die Proteinmenge von Gurken an der Plasmamembran ist in den Oocyten drastisch reduziert. Außerdem fehlt Gurken in den umliegenden Follikelzellen. Gurken befindet sich in punktartigen Strukturen im Cytoplasma, die nicht mit dem ER kolokalisieren. Die Lokalisation des Plasmamembranproteins Yolkless bleibt dagegen unverändert. Ausgehend von diesen Beobachtungen scheint Sec61b bei einer Gruppe von Proteinen einen Transportschritt in einem post-ER-Kompartiment zu beeinflussen. Dieser Effekt könnte indirekt sein, falls Sec61b die Lokalisation von Proteinen beeinflußt, die eine Funktion beim Transport von Gurken besitzen. Sec61b interagiert mit dem Exocyst-Komplex und Gurken benötigt den Exocyst-Komplex für seine Lokalisation zur Plasmamembran. Demzufolge könnte das Fehlen von Sec61b einen direkten Transportdefekt von Gurken bewirken. Die ectopische Expression von Sec61_ in Flügeln von Drosophila führt zu spezifischen morphologischen Veränderungen und zum Verlust von Flügeladern. Diese Phänotypen zeigen Ähnlichkeit zu den bei EGFR-Signaldefekten beobachteten und deutet auf einen Einfluß von Sec61b bei der Biogenese einer spezifischen Gruppe von Molekülen auch während anderer Stadien des Entwicklungsprozeß hin. Im Verlauf der M-Phase des Zellzyklus wird Sec61b durch die cdc2-Kinase phosphoryliert. Die Phosphorylierung erfolgt sowohl beim humanen als auch beim Drosophila Protein an einem stark konservierten Serin innerhalb eines cdc2-Konsensus Motivs. Die Mutation dieser Position kann die Lethalität des sec61bP1 -Alles nicht vollständig komplementieren. Die ectopische Expression des mutierten Proteins in Flügeln verstärkt die morphologischen Veränderungen im Vergleich zur Expression des Wildtyp Proteins. Dies deutet darauf hin, daß die Phosphorylierung von Sec61_ die funktionellen Eigenschaften von Sec61b verändert. Sec61b scheint eine essentielle Rolle bei der Sekretion zu spielen und die Phosphorylierung könnte eine zusätzliche Regulationsmöglichkeit darstellen.

Translation of abstract (English)

Secretory and membrane proteins are translocated across or inserted into the ER membrane by an aqueous channel called the Sec61 complex. The Sec61 complex consists of three subunits, a subunit which forms the actual channel, and b and g subunits which associate with the channel. The present study was aimed at investigating the function of Sec61b in Drosophila and characterization of Sec61b phosphorylation. Germline clones of the Sec61b loss of function allele (sec61bP1) lack Sec61b in the oocytes. Embryos which are formed from these oocytes show perturbations in the dorsal-ventral polarity suggesting changes in protein amounts and localization of Gurken, an EGFR ligand in the oocyte. In these oocytes amount of Gurken at the plasma membrane is drastically reduced. Gurken is also absent from the surrounding follicle cells. Gurken is localized to punctuate structures in the cytoplasm, which do not co-localize with ER. Localization of the plasma membrane protein, Yolkless, remains unchanged. Based on these observations it seems that Sec61b affects a post-ER step during trafficking of a subset of proteins to the plasma membrane. The defect can be indirect when Sec61b affects localization of proteins which play a role in Gurken traffic. Sec61b interacts with the exocyst complex and Gurken needs the exocyst for plasma membrane localization, hence lack of Sec61b may directly affect Gurken traffic. Ectopic expression of Sec61b in the Drosophila wings causes specific changes in the wing morphology and loss of wing veins. These phenotypes are similar to the phenotypes seen in mutants affecting EGFR signalling and trafficking of EGFR ligands. This indicates that Sec61b may affect biogenesis of a specific set of molecules during other developmental processes too. Sec61b is phosphorylated by the cdc2 kinase during the M-phase of the cell cycle. Phosphorylation occurs in both human and the Drosophila protein at a highly conserved serine residue at a consensus cdc2 kinase phosphorylation site. Sec61b protein with mutation in this residue does not completely rescue the lethality caused by sec61bP1 allele. Ectopic expression of the mutant protein in the wing enhances the morphological changes seen by ectopic expression of the wild type protein. This indicates that phosphorylation of Sec61b may affect the functional properties of Sec61b. Sec61b seems to play an essential role during secretion and phosphorylation may represent an additional level of regulation.