German Title: Die PUF Proteine in Trypanosoma brucei

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Abstract

The protozoan parasite Trypanosoma brucei, which causes human sleeping sickness, has to adapt to rather different environments as it cycles between the mammalian host and the tsetse fly vector. This adaptation is mediated by changes in trypanosome gene expression, which are mainly regulated at the post-transcriptional level. Proteins with an RNA-binding "Puf" domain are important for post-transcriptional control by modulation of mRNA stability and regulation of translation in other species. This suggested that Puf domain proteins might also have a similar role in trypanosomes. In addition to the previously characterized TbPUF1 (Hoek, Zanders et al. 2002) I have identified eight more PUF genes in the T. brucei genome. A comparison of the characteristic RNA binding domain of T. brucei PUF proteins suggested that they bind related but distinct targets. Interestingly, each of the PUF protein has an orthologue in Trypanosoma cruzi and Leishmania major. Phylogenetic analysis suggested that there were several kinetoplastid PUF proteins before separation from the eukaryotic lineage. Depletion of each of the nine T. brucei PUF proteins by RNA interference did not result in an obvious phenotypic change. Furthermore, PUF1 knock out procyclic cell lines were viable, indicating that this PUF protein is not essential for in vitro growth. Additionally, double RNAi analyses suggested that the proteins tested did not share redundant functions in T. brucei. Microarray studies comparing wild-type cells with cells where PUF levels have been perturbed (either by RNAi or overexpression) revealed one putative mRNA target for PUF5: CAP17 (corset associated protein 17) mRNA is downregulated upon overexpression of PUF5 in the insect form of the parasite. Interestingly, PUF5 overexpression was also lethal for procyclic cells. Multiple mRNAs which associated with PUF proteins in mRNP complexes were identified. PUF5 for example, selectively binds to mRNAs encoding for amino acid transporters in bloodstream form cells. Attempts to identify PUF interaction partners have so far failed. The effect of PUF proteins on global protein expression level was also investigated using two-dimensional gel electrophoresis approach. A few proteins which were differentially regulated upon RNAi or knockout of PUF proteins were identified. These results indicated that PUF proteins in T. brucei, as is true for PUF proteins in general, are involved in regulating gene expression.

Translation of abstract (German)

Die Schlafkrankheit wird durch den Parasiten Trypanosoma brucei hervorgerufen. Dieser einzellige Erreger wird durch die Tsetse-Fliege von einem Säugerwirt zum nächsten übetragen. Die hohe Adaptionsfähigkeit des Erregers beruht auf der Regulation der Genexpression, die bei Trypanosomen hauptsächlich post-transkriptionell abläuft. Proteine mit einer RNS-bindenden „Puf“ Domäne spielen in anderen Eukaryonten eine wichtige Rolle in der post-transkriptionellen Kontrolle; sie modulieren die Stabilität der RNS und regulieren die Translation. Es ist zu erwarten, dass PUF Proteine diese Rolle auch in Trypanosomen haben. Zusätzlich zum charakterisierten TbPUF1 (Hoek, Zanders et al. 2002) wurden während dieser Arbeit acht weitere PUF Proteine in T. brucei identifiziert. Ein Vergleich der RNS-bindenden Domäne lässt vermuten, dass PUF Proteine in T. brucei ähnliche aber unterschiedliche mRNS binden. Interessant ist, dass orthologe PUF Proteine auch in Trypanosoma cruzi und Leishmania major vorkommen. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass kinetoplastide PUF Proteine schon vor der Abspaltung von der eukaryotischen Abstammungslinie existierten. Die Expression jedes einzelnen PUF Proteins wurde mitttels RNAi gehemmt. Dies führte jedoch nicht zu offensichtlichen phänotypischen Veränderungen in T. brucei. Die gleichzeitige Hemmung der Expression von zwei PUF Proteinen hatte ebenfalls keinen ersichtlichen Phänotyp zur Folge und lässt vermuten, dass PUF Proteine keine redundanten Funktionen in T. brucei ausüben. Auch die gezielte Inaktivierung des PUF1 Gens mittels „Knockout“ hatte keine Folgen. Desweiteren konnten Microarraystudien, die Wildtypzellen mit PUF-RNAi oder -überexprimierenden Zellen verglichen, eine Ziel-mRNA für PUF5 identifizieren. Die Menge an CAP17 (corset-associated protein 17) mRNA wird bei Überexpression von PUF5 in prozyklischen Zellen reduziert. Auch ist die Überexpression von PUF5 für T. brucei tödlich. Zudem konnte gezeigt werden, dass verschiedene mRNS assozieren mit PUF Proteinen in mRNP Komplexen. PUF5 zum Beispiel bindet spezifisch RNS, die Aminosäuretransporter kodieren. Versuche, PUF-Interaktionspartner in T. brucei zu finden, blieben erfolglos. Der Einfluss von PUF Proteinen auf die globale Proteinexpression wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese untersucht. Die Expression einiger Proteine verändert sich in PUF-RNAi und PUF1 knockout Zell-Linien. Diese Resultate lassen darauf zurückschliessen, dass PUF Proteine auch in Trypanosomen in die Kontrolle der Genexpression involviert sind.