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Development and application of a high throughput cell based assay to identify novel modulators of ERK1/2 activation and,Functional characterisation of the candidate Radial spokehead like (Rshl1)

Majety, Meher Vinay Krishna Mohan

German Title: Entwicklung and Anwendung eines hochdurchsatz-zellbasierten assay, um neue Modulatoren der ERK1/2 activierung zu identifizieren und funktionelle Charakterisierung des kandidaten "Radial spokehead like 1"

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The aim of my project was to identify and functionally characterise novel human proteins that influence cancer relevant cellular processes like cell proliferation, signalling, and apoptosis upon over-expression. The focus of my work was 1) The establishment of a high throughput cell based assay to screen for proteins involved in the modulation of cell signalling pathways, specifically the activation of the ERK1/2 pathway, 2) to apply this assay in a screen of previously uncharacterised proteins, and 3) to characterise one candidate protein from this assay and to validate its association with the ERK1/2 pathway. The principle of the assay is based on the detection of phosphorylated ERK1/2 in cells over-expressing N- and C-terminal YFP tagged proteins. Data acquisition was done using a flow cytometer with an integrated 96-well plate reader. A total of 200 proteins were screened, out of which eleven novel cancer relevant modulators of ERK1/2 activation were identified. One of the candidates, the Radial spoke head like -1 (Rshl1), which was identified as an inhibitor of ERK1/2 activation was followed up, and shown to be down regulated in kidney cancer. The protein was identified as an inhibitor of proliferation in another cell based assay. The corresponding gene is located on chromosome 19q13.3 at the primary ciliary dyskinesia locus, and the encoded protein contains a radial spoke domain. However, the biological role of this protein was not described. I found that Rshl1 indeed localizes to primary cilia but also to the cytoplasm and nucleus of human kidney cells. Further, I found that its localisation is cell cycle phase dependent. Rshl1 co-localised with MEK1, ERK1/2 and CDK2 and interacts with MEK1, CDK2 and ERK3. Its role as an inhibitor of proliferation was elucidated by the finding that over-expression of Rshl1 caused a G0/G1 phase arrest in human kidney cells via an up-regulation of p57KIP2 expression and stabilization of ERK3. Rshl1 thus regulates the cell cycle by inhibiting the ERK1/2 kinase. It interacts with critical signalling proteins in the cell and maintains homeostasis by arresting cells in the G0/G1 phase. In conclusion, I screened 200 novel proteins for their influence on ERK1/2 activation and identified eleven novel modulators of ERK1/2 pathway. Detailed functional analysis of Rshl1, which was an inhibitor of ERK1/2 activation, identifies this protein as a novel player in the MAPK pathway, and shed light on its role in homeostasis and tumorigenesis.

Translation of abstract (English)

Das Ziel dieses Projektes war die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung unbekannter Proteine die, nach Überexpression, Krebs-relevante zelluläre Prozesse wie z.B. Proliferation, Signaltransduktion und Apoptose beeinflussen. Der Fokus meiner Arbeit lag in der Etablierung eines zellbasierten Hochdurchsatz-Assays zur Untersuchung von Proteinen auf die Modulation von Zell-Signalwegen, im Speziellen der Aktivierung des ERK1/2- Signalweges. Das Prinzip des Assays basiert auf der Detektion der phosphorylierten Form von ERK1/2 in Zellen, die Fusionsproteine mit N- und C-terminalem YFP überexprimieren. Die Datenaufnahme wurde mit einem Durchflußzytometer mit integriertem 96-Well-Platten Lesegerät durchgeführt. Insgesamt wurden 200 Proteine untersucht, von denen schließlich sieben als Krebs-relevante ERK1/2-Modulatoren identifiziert wurden. Einer der Kandidaten, das Radial Spoke Head Like-1 (Rshl1) Protein, welches als Inhibitor der ERK1/2 Kinase identifiziert wurde, habe ich im Rahmen meiner Arbeit funktionell charakterisiert. In vorherigen Studien wurde gezeigt, dass Rshl1 in Nierenkrebs herunter reguliert ist und es wurde als Inhibitor der Proliferation beschrieben. Das Rshl1-Gen ist auf Chromosom 19q13.3 im Primary Ciliary Dykinesia Lokus lokalisiert und das Protein enthält eine Radial-Spoke-Domäne, jedoch ist die biologische Funktion bisher nicht bekannt. In der vorliegenden Studie habe ich die Lokalisation des Rshl1 Proteins in primären Cilien, im Cytoplasma und im Kern von Nierenzellen nachgewiesen und konnte eine Zellzyklus-abhängige Lokalisation feststellen. Ich habe gezeigt, dass Rshl1 mit den Proteinen MEK1, ERK1/2 und CDK2 co-lokalisiert und habe seine direkte Interaktion mit MEK-1, CDK2 und ERK3 nachgewiesen. Seine Rolle als Inhibitor der Proliferation wurde durch die Blockade von Nierenzellen mit Rshl1-Überexpression in der G0/G1-Phase des Zellzyklus, sowie durch die verstärkte Expression des Zellzyklus-Repressors p57KIP2 und die Stabilisierung von ERK3 erläutert. Diese Studie zeigt somit zum ersten Mal, dass Rshl1 den Zellzyklus durch die Inhibierung der ERK1/2-Kinase reguliert. Es interagiert mit Schlüsselproteinen der Signaltransduktion und erhält das Gleichgewicht während der G0/G1-Phase des Zellzyklus. Zusammengefasst habe ich 200 Proteine auf ihren Einfluss auf die ERK1/2-Aktivierung untersucht und sieben neue Modulatoren des ERK1/2-Signalweges identifiziert. Die Ergebnisse aus der detaillierten funktionellen Analyse des Proteins Rshl1, für das eine Inhibierung des ERK1/2-Siganlweges nachgewiesen wurde, bestätigt die Stärke und Effizienz dieses Ansatzes und hebt die Bedeutung einer solchen Untersuchung im Rahmen der funktionellen Genomanalyse hervor.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Stefan PD. Dr, Wiemann
Date of thesis defense: 23 October 2006
Date Deposited: 26 Oct 2006 15:07
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: High throughput screening, MAP-Kinase, Signaling, FACS
Uncontrolled Keywords: Cell cycle regulation , cilia
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