German Title: Funktionelle charakterisierung der Phosphatase hCdc14B und ihre Rolle in der Mitose

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Abstract

Progression through the cell cycle requires coordinated activity of kinases and phosphatases. Cdk1/cyclin B is a major kinase that promotes entry into and progression through early mitosis. Exit from mitosis requires down-regulation of Cdk1/cyclin B as well as reversal of Cdk1/cyclin B-mediated phosphorylations. In budding yeast, the nucleolar phosphatase Cdc14 (yCdc14) triggers mitotic exit by dephosphorylating mitotic Cdk/cyclin target proteins, promoting degradation of mitotic regulators, and inactivating mitotic Cdk/cyclin complexes. In contrast to yeast, hCdc14B, a human homologue of yCdc14, is poorly characterized. The aim of this study was to investigate a potential regulatory function of hCdc14B in mitosis. To address this issue, a variety of experimental approaches were used, including the generation of transgenic human cell lines, gene silencing by RNAi, protein-interaction assays, determination of phosphatase and kinase activities, purification and size fractionation of cellular protein complexes as well as chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) and fluorescence microscopy. HeLa and U2OS cell lines were established that express Flag-, Flag-HA-, or TAP-tagged wildtype hCdc14B or a catalytically defective mutant, called hCdc14BPD. Analysis of U2OS cell lines that stably express either wildtype hCdc14B or the phosphatase-deficient mutant under the control of a tetracycline-inducible promoter showed that ectopic hCdc14B caused a delay in mitotic entry, while overexpression of the enzymatic inactive form prolonged mitosis and delayed exit from mitosis. These data were supported by siRNA-directed silencing of hCdc14B expression, demonstrating that ablation of hCdc14B leads to accumulation of bi- and multinucleated cells, delay in meta- to anaphase transition and finally to mitotic arrest and cell death. To dissect the molecular mechanism underlying hCdc14B function, the phosphorylation state and activity of selected key regulators of mitosis were analyzed. These studies revealed that hCdc14B dephosphorylates the mitotic phosphatase Cdc25, which is required for activation of Cdk1/cyclin B at the G2/M transition and during early stages of mitosis. Overexpression of hCdc14B suppressed Cdc25 activity, leading to accumulation of Cdk1 phosphorylated at T14/Y15 and a substantial delay in Cdk1/cyclin B activation. In contrast, Cdk1/cyclin B activity remained elevated in cells depleted of hCdc14B. The results suggest that hCdc14B interrupts the positive feedback loop between Cdc25 and Cdk1/cyclin B and promotes progression through late mitosis. ChIP revealed a preferred binding of hCdc14B to the intergenic spacer region of ribosomal RNA genes (rDNA). Binding to rDNA was abrogated during mitosis, indicating that hCdc14B associates with rDNA in a cell cycle-dependent fashion. In support of this, analysis of the subcellular distribution of hCdc14B throughout the cell cycle revealed that hCdc14B is bound to chromatin during interphase and released from chromatin from prometaphase until early G1-phase. Size fractionation by gel filtration revealed that hCdc14B is contained in one major protein complex with a molecular weight of 400-600 kDa. During mitosis the majority of hCdc14B was monomeric with a small portion being contained in different protein complexes suggesting that during the cell cycle hCdc14B associates with different interaction partners. To identify proteins that interact with and are dephosphorylated by hCdc14B, hCdc14B complexes were isolated from human cells that overexpress Flag-HA-tagged hCdc14B by sequential immunopurification, and co-purifying proteins were subjected to mass spectrometry. This analysis identified APC1, the largest subunit of the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), and ELP1, an RNA polymerase II specific elongation factor. The interaction between hCdc14B and APC/C was confirmed by co-immunoprecipitation experiments revealing that hCdc14B interacts with a distinct subform of the APC/C complex, APC/CCdh1 that forms during late mitosis and regulates proteosome-dependent degradation of mitotic regulators at the exit from mitosis and during G1-phase. Studies carried out in the present work provide first evidence that hCdc14B is an essential regulator of late mitotic events and reveal the molecular mechanisms underlying hCdc14B function.

Translation of abstract (German)

Der Ablauf des Zellzyklus wird durch die phasen-spezifischen Aktivitäten von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen entscheidend gesteuert. Die Cyclin-abhängige Kinase Cdk1/Cyclin B ist insbesondere für den Eintritt in die Mitose und frühe Phasen der Mitose erforderlich. Umgekehrt erfordert der Austritt aus der Mitose eine Inaktivierung dieser mitotischen Kinase, sowie die Dephosphorylierung von Substraten, die durch Cdk1/Cyclin B modifiziert worden waren. Für den Austritt aus der Mitose ist in der Bäckerhefe die nukleoläre Phosphatase Cdc14 (yCdc14) essentiell. yCdc14 dephosphoryliert zum einen Substratproteine an mitotischen Cdk1 Zielsequenzen, und fördert dadurch den Abbau von Proteinen, die die Mitose steuern und vorantreiben, und inaktiviert zum anderen mitotische Cdk/Cyclin Komplexe. Obwohl Cdc14 in der Bäckerhefe gut charakterisiert ist, ist wenig über die homologe Phosphatase im Mensch bekannt. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, eine Funktion von hCdc14B in der Regulation der Mitose in Menschzellen zu untersuchen. Es wurden HeLa and U2OS Zelllinien generiert, die Flag-, Flag-HA-, or TAP- hCdc14B Wildtyp bzw. eine katalytisch defekte Punktmutante, hCdc14BPD, exprimieren Die Analysis von U2OS Zellinien, die stabil unter der Kontrolle eines mit Tetrazyklin induzierbaren Promotors exprimieren zeigte, dass die Überexpression von hCdc14B Wildtyp den Eintritt in die Mitose verzögert, während durch Überexpression der enzymatisch inaktiven Punktmutante die Mitose verlängert oder der Austritt aus der Mitose verzögert wird. Diese Befunde wurden maßgeblich durch siRNA-Experimente erhärtet, die zeigten, dass die zelluläre Depletion von hCdc14B zu einer Anhäufung von zwei- und mehrkernigen Zellen führt, zu einer Verzögerung des Übertritts von der Metaphase in die Anaphase, sowie, letztendlich, zur Arretierung in der Mitose und zum Zelltod. Zur Identifizierung der molekularen Mechanismen wurden der Phosphorylierungsgrad und die Aktivität ausgewählter Regulatoren der Mitose untersucht. Dies zeigte, dass hCdc14B die mitotische Phosphatase Cdc25, die sowohl für die Aktivierung von Cdk1/Cyclin B an der G2/M-Grenze als auch für den korrekten Ablauf der frühen Mitosestadien erforderlich ist, dephosphoryliert. Die Überexpression von hCdc14B führte zur Hemmung von Cdc25, zur Akkumulierung von Cdk1, die an T14/Y15 inhibitorisch phosphoryliert war und daher zu einer erheblichen Verzögerung der Aktivierung des Cdk1/Cyclin B Komplexes. Andererseits fehlte die zeitgerechte Inaktivierung von Cdk1/Cyclin B in Zellen, in denen hCdc14B durch siRNAs depletiert worden war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass hCdc14B die positive Feedback Schleife zwischen Cdc25 und Cdk1/Cyclin B zerstört und so das Durchschreiten der späten Stadien der Mitose vorantreibt. Chromatinimmunpräzipitationsversuche zeigten, dass hCdc14B bevorzugt mit dem „Intergenen Spacer“ (IGS) der ribosomalen RNA Gene (rDNA) assoziiert ist. Die Binding an die rDNA erfolgt zellzyklus-spezifisch, da hCdc14B nur während der Intrphase, nicht jedoch während der Mitose mit rDNA assoziiert war. Auch durch Fraktionierung von Zellextrakten konnte die zellzyklus-abhängige nachgewiesen werden, dass sich die subzelluläre Lokalisation von hCdc14B während des Zellzyklus ändert. hCdc14B ist in der Interphase an Chromatin gebunden, jedoch von der Prometaphase der Mitose bis zur frühen G1-Phase löslich. Die native Größenbestimmung von hCdc14B durch Gelfiltration zeigte, dass hCdc14B in der Interphase in einen hochmolekularen, ca. 500 kDa großen Proteinkomplexes integriert ist. Während der Mitose hingegen liegt hCdc14B größtenteils als Monomer vor, eine Subfraktion von hCdc14B ist jedoch auch mit Proteinkomplexen unterschiedlicher Größen assoziiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hCdc14B während des Zellzyklus mit verschiedenen Proteinpartnern interagiert. Um Interaktionspartner und Substrate von hCdc14B zu identifizieren, wurden hCdc14B Proteinkomplexe durch sequentielle Immunpräzipitation aus Menschzelllinien, die Flag-HA-hCdc14B exprimieren, isoliert und assoziierte Proteine durch Massenspektrometrie analysiert. In diesen Untersuchungen wurden APC1, die größte Untereinheit des „Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosome“ (APC/C), sowie ELP1, ein RNA Polymerase II-spezifischer Elongationsfaktor, identifiziert. Die Interaktion zwischen hCdc14B und APC/C wurde durch Co-immunopräzipitationsversuche bestätigt. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass hCdc14B mit einer bestimmten Form des APC/C Komplexes, nämlich APC/CCdh1, assoziiert. Die in dieser Arbeit durchgeführten Studien zeigten zum ersten Mal, dass die Phosphatase hCdc14B einen essentieller Regulator der Mitose darstellt. Es konnten molekulare Mechanismen aufgedeckt werden, die der Regulation der Mitose durch hCdc14B zugrunde liegen.