English Title: Synthesis, Characterisation and Evaluation of Antibody Conjugates with Dendrimer-Based Chelator- and Fluorescent Dye Multimers for Cancer Diagnosis and Therapy

Preview

PDF, German Download (5MB) | Terms of use

Abstract

Für eine Verbesserung der radiometallbasierten Diagnostik und Therapie sowie der Diagnostik mittels Fluoreszenzfarbstoffen wurden Chelatbildner- und Fluoreszenz-farbstoff-Multimere auf der Basis von PAMAM-Dendrimeren hergestellt. Diese wurden in den EGF-Rezeptor bindenden Antikörper Matuzumab eingeführt und die synthetisierten Antikörper-Multimer-Konjugate hinsichtlich ihrer Immunreaktivität untersucht. Für die Herstellung der Multimere musste zunächst die Synthese der PAMAM-Dendrimere optimiert werden, da mittels publizierter Methoden nur Dendrimere unzureichender Homogenität erhalten werden konnten. Hierdurch war es möglich, Dendrimere mit einer bis 128 Aminfunktionen in hoher Homogenität herzustellen. Die Dendrimere wurden auf einem Pentaethylenglycol-Linker aufgebaut, der eine Thiol-Funktion für die Umsetzung mit Antikörpern trug. Es wurde eine große Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Multimerisierbarkeit auf diesen Dendrimer-Cores untersucht. Allerdings wiesen nur Dansylchlorid, NBD-chlorid, Coumarin 343, 5(6)-Carboxyfluorescein-pentafluorphenylester und Sulforhodamin B2 Fluorid ausreichend hohe Reaktivitäten mit den Aminfunktionen der PAMAM-Dendrimere auf. Die Untersuchung der Fluoreszenzeigenschaften der hergestellten Farbstoff-Multimere zeigte allerdings, dass sich für eine Multimerisierung zur Verstärkung von Fluoreszenzsignalen einzig Dansylchlorid eignet. Folglich wurden Dansyl-Multimere mit 1 bis 128 Dansylresten synthetisiert und mittels Größenausschlusschromatographie, HPLC, NMR und Massenspektroskopie charakterisiert. Die Dansyl-Multimere Dansyl8-SH, Dansyl16-SH, Dansyl32-SH und Dansyl64-SH wurden in den anti-EGFR Antikörper Matuzumab eingeführt, wobei sich zeigte, dass sich die größeren Dansyl-Multimere Dansyl32-SH und Dansyl64-SH nicht für eine Derivatisierung von Antikörpern eignen, da sie, wahrscheinlich aufgrund ihrer hohen Lipophilie, bei Einführung in das Protein zur Denaturierung des Antikörpers führten. Das Dansyl16-Antikörper-Konjugat war somit das größte herstellbare Konjugat, das isoliert und charakterisiert werden konnte. Diese Verbindung wurde an HT29-Zellen hinsichtlich ihrer Immunreaktivität untersucht und zeigte relativ zum underivatisierten Antikörper eine zu 54% erhaltene Immunreaktivität. Für die Herstellung der Chelat-Multimere wurden zunächst die bekannten Syntheseprotokolle der als Synthon benötigten DOTA-Derivate Tris-tBu-DOTA, Thiol-DOTA und Tris-benzyl-DOTA verbessert. Neben diesen Derivaten wurden weiterhin Tris-allyl-DOTA, DOTA-PFP-ester und DOTA–PNP-ester sowie ein neues Derivat, Tris-4-nitrobenzyl-DOTA, hergestellt und mit den Dendrimeren umgesetzt. Einzig Thiol-DOTA ließ sich quantitativ in die Dendrimere einführen und ergab die gewünschten Chelat-Multimere mit 1 bis 128 DOTAs in hoher Homogenität, die nach ihrer vollständigen Charakterisierung in den Antikörper Matuzumab eingeführt wurden. Dabei wurde sowohl die Anzahl als auch die Größe der eingeführten Multimere variiert, um systematisch zu untersuchen, welchen Einfluss die Größe und die Anzahl der gekoppelten Dendrimere auf die Immunreaktivität der derivatisierten Antikörper haben. Es sollte herausgefunden werden, ob ein Optimum mit größtmöglicher Anzahl von Chelatbildnern und geringst möglicher Verschlechterung der Immunreaktivität erreicht werden kann. Die erhaltenen Antikörper-Multimer-Konjugate wurden hinsichtlich ihrer Immunreaktivität an HT29-Zellen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Größe des angekoppelten DOTA-Multimers über einen weiten Molekulargewichtsbereich nur einen geringen Einfluss auf die Immunreaktivität des Antikörper-Konjugates hat, dass jedoch die Anzahl der Derivatisierungsstellen pro Antikörper einen drastischen Einfluss auf die Immunreaktivität der Konjugate hat.

Translation of abstract (English)

For an improved radiometal-based diagnosis and therapy and diagnosis by optical imaging, chelator- and fluorescent dye-multimers based on PAMAM-dendrimers were synthesised. These multimers were introduced into the anti-EGFR-antibody Matuzumab and the conjugates synthesised were investigated with regard to their immunoreactivities. For the synthesis of the multimers on the PAMAM-dendrimer scaffolds, the PAMAM-dendrimer synthesis had to be optimised as the published protocols lead to highly heterogeneous dendritic structures. After optimisation of the synthesis procedures, homogeneous PAMAM-dendrimers containing 1 to 128 amino functions could be synthesised on a pentaethyleneglycol linker that provides an improved reactivity of the thiol for the antibody conjugation. These dendrimers were used for multimerisation reactions with fluorescent dyes. A high number of fluorescent dyes was investigated with regard to their coupling efficiencies to the amino functions of the dendrimers. However, only dansyl chloride, NBD-chloride, Coumarin 343, 5(6)-carboxyfluorescein-pentafluorophenyl-ester and sulforhodamine B2 acid fluoride could be coupled with high efficiency leading to homogeneous products. The investigation of the fluorescence properties of the synthesised dye-multimers showed a strong self-quenching of fluorescence of the NBD-, Coumarin 343-, carboxyfluorescein- and sulforhodamine-multimers which can be attributed to the small Stokes-shift of the dyes. In contrast to this, the dansyl-multimers showed just a minor self-quenching of fluorescence which makes only dansyl chloride applicable for multimerisation reactions leading to higher fluorescence signals. Due to this, dye-multimers containing from 1 to 128 dansyl moieties were synthesised and characterised. The dansyl-multimers Dansyl8-SH, Dansyl16-SH, Dansyl32-SH and Dansyl64-SH were introduced into the antibody Matuzumab, however, it could be observed that the larger multimers containing 32 and 64 dansyl moieties led to the denaturation of the coupling products which is probably due to the high lipophilicity of the dye-multimers. The highest number of dansyl moieties that could be introduced into the antibody molecule was therefore 16. The Dansyl16-antibody-conjugate was isolated and characterised by size-exclusion chromatography, HPLC, NMR and mass spectrometry. Its immunoreactivity was determined using HT29-cells and found to be 54% of the underivatised antibody. For the synthesis of the chelate-multimers, the synthesis protocols for the DOTA-derivatives tris-tBu-DOTA, thiol-DOTA and tris-benzyl-DOTA had to be optimised. Besides these derivatives, tris-allyl-DOTA, DOTA-PFP-ester, DOTA–PNP-ester and a new compound, tris-4-nitrobenzyl-DOTA, were synthesised and reacted with the amino functions of the PAMAM-dendrimers. Of the studied derivatives, only thiol-DOTA could be quantitatively introduced into the dendrimers and yielded the highly homogeneous DOTA-multimers containing 1 to 128 DOTAs. These multimers were characterised and introduced into the antibody Matuzumab. To systematically investigate the influence of the number and the size of the introduced DOTA-multimers on the immunoreactivity of the antibody-multimer-conjugates, the number and the size of the DOTA-multimers coupled were varied. The conjugates were investigated with regard to their immunoreactivities using HT29-cells. The results showed that the size of the introduced DOTA-multimers has over a wide molecular weight range just a minor influence on the immunoreactivity of the conjugates whereas the number of derivatization sites has a crucial effect on the immunoreactivities of the conjugates.