English Title: Targeted inhibition of human Papillomavirus E7 function via RNA interference and peptide inhibitors

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Abstract

Spezifische Typen humaner Papillomviren (HPVs) verursachen das Zervixkarzinom, die zweithäufigste Krebsart bei Frauen weltweit. Bisherige Therapien sind nicht HPV-spezifisch und können unerwünschte Nebenwirkungen mit sich bringen. Die Entwicklung neuer HPV-spezifischer Therapieansätze war daher das übergeordnete Ziel dieser Studie. Da Wachstum und Überleben HPV-positiver Krebszellen von der fortlaufenden Expression und funktionellen Kooperation der viralen Onkogene E6 und E7 abhängen, kann die gezielte Inhibition der viralen Onkogene einen spezifischen Therapieansatz bieten. In dieser Studie konnte erstmalig eine HPV18 E7-spezifische shRNA generiert werden. Weiterhin konnten mit Hilfe des Yeast Two-Hybrid Systems sechs Peptide identifiziert werden, die in der Hefe und in Säugerzellen an das E7-Protein von HPV18 binden. Diese Bindung ist hochspezifisch. Biochemische und funktionelle Studien mit der shRNA und den Peptiden validierten E7 als therapeutisches Zielprotein. So resultierte die Hemmung von E7 in einer Proliferationshemmung HPV-positiver Karzinomzellen, einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase und letztendlich in Seneszenz. Neben der post-transkriptionell wirksamen shRNA konnten außerdem drei Promotor-spezifische siRNAs identifiziert werden, welche die Aktivität der transkriptionellen Kontrollregion von HPV18 inhibierten. Für die Entwicklung neuer Therapieansätze ist es weiterhin wichtig, detaillierte Einblicke in die Mechanismen der HPV-assoziierten Karzinogenese zu gewinnen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass onkogene HPVs das humane Enhancer of Zeste homolog 2 (EZH2)-Gen aktivieren. Reportergenanalysen zeigten, dass EZH2 primär über den E7/pRb/E2F-Signalweg aktiviert wird. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die fortlaufende EZH2-Expression essentiell für Proliferation und Überleben HPV-positiver Krebszellen ist. Immunhistochemische Analysen zeigten eine Korrelation zwischen der viralen Onkogenexpression und erhöhten EZH2-Expressionsspiegeln in HPV-positiven Läsionen. Diese Ergebnisse definieren EZH2 als ein neues Zielgen für das HPV E7-Onkoprotein. Die in der vorliegenden Arbeit generierten Inhibitoren ermöglichen erstmals eine gezielte Hemmung der endogenen E7-Aktivität in HPV-positiven Karzinomzellen. Sie sollten daher auch für weitere Funktionsstudien von E7 hilfreich sein. Aufgrund ihrer zielgerichteten Wirkweise könnten die E7-Inhibitoren außerdem eine erste Grundlage für die Entwicklung spezifischer Therapieansätze zur Behandlung HPV-positiver präneoplastischer und neoplastischer Läsionen bieten.

Translation of abstract (English)

Cervical cancer represents the second most common cancer in women worldwide and is almost regularly caused by oncogenic types of human papillomaviruses (HPVs). Current therapies can cause severe side-effects as they are not HPV-specific. Therefore, the overall aim of this study was to develop novel HPV-specific therapeutic approaches. Both the proliferation and viability of HPV-positive cancer cells depend on the concerted action of the viral E6 and E7 oncogenes. Therefore, targeting the viral oncogenes for functional inhibition could provide a rational approach for therapy. This study, for the first time, identified a shRNA which can specifically inhibit HPV18 E7 expression. In addition, the yeast two-hybrid technology allowed the identification of six peptides which interact with the HPV18 E7 protein, both in yeast and mammalian cells. Binding of the peptides to E7 was highly specific. Results from biochemical and functional analyses with shRNA and peptides validated E7 as a therapeutic target, since inhibition of E7 in HPV-positive cancer cells acted anti-proliferative by inducing cell cycle arrest in G1 and eventually led to senescence. Besides the post-transcriptional active shRNA, three promoter-directed siRNAs were identified which blocked the activity of the HPV18 upstream regulatory region. Further insight into the mechanism of HPV-associated carcinogenesis was gained by the identification and characterization of the Enhancer of Zeste homolog 2 (EZH2) gene as novel HPV target gene. Reportergene analyses revealed transcriptional induction of the EZH2 promoter by E7 via the pRb-E2F-pathway. Inhibition of EZH2 expression in HPV-positive cells led to cell cycle arrest in G1, reduced cell growth, and apoptosis. In addition, immunohistochemical analyses of tissue samples derived from normal tissue, dysplasia, or tumor tissue revealed that HPV-positive lesions show high EZH2 expression levels. Thus, the results of this study define EZH2 as a novel target gene for HPV E7. Furthermore, the E7-specific inhibitors allow, for the first time, the targeted inhibition of endogenous E7 activity. They therefore should provide useful tools for further functional analyses of E7. Notably, the specific effect of these inhibitors on E7 may provide a novel basis for the development of therapeutic strategies for the treatment of HPV-positive preneoplastic and neoplastic lesions.