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Genome-wide analysis of C99-overexpressing human neuroblastoma cells : effects of C99 cleavage products on gene expression, signal transduction and phosphorylation status

Uhrig, Markus

German Title: Genomweite Analyse C99-überexprimierender humaner Neuroblastomzellen : Effekte von C99-Spaltprodukten auf die Genexpression, Signaltransduktion und den Phosphorylierungsstatus

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The human genome comprises approximately 20,000-25,000 genes. The genes known to be involved in Alzheimer’s disease (AD) are the amyloid precursor protein (AbetaPP), presenilin 1 (PS1), presenilin 2 (PS2) and apolipoprotein E (APOE). However, which additional genes are involved in its etiology is a controversial topic. C99, the C-terminal cleavage product of AbetaPP is the direct, in vivo occurring, precursor of Abeta-peptides. It is proteolytically processed, resulting in the generation of several Abeta-peptides. In contrast to the form with 40 amino acids (Abeta40), which is regarded as the physiological form, the variant with 42 amino acids (Abeta42) is thought to be the pathogenic form triggering the pathophysiological cascade in AD. In order to produce different Abeta42 and Abeta40 levels, the Abeta precursors C99I45F and C99V50F (two C99 mutants, known to generate different amounts of Abeta42 and Abeta40) were overexpressed in human neuroblastoma cells. This resulted, due to varying intracellular cleavage by gamma-secretase, in different Abeta42 and Abeta40 levels accompanied by the generation of their respective APP intracellular domains (AICDs). The goal of this thesis was to obtain information about effects of the different C99 cleavage products. Therefore different C99 mutants were overexpressed in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y resulting in different Abeta42/Abeta40 levels and a genome-wide transcriptomic (Affymetrix) and proteomic response of these cells was monitored. As was expected, many genes previously reported to be associated with AD were found to be differentially expressed. Importantly, further genes, not yet linked to AD, have been identified and new cross-talk between genes/proteins has been suggested. The genes assumed to play a predominant role in response to altered C99 cleavage products are indicated in brackets and full gene names are to be found in Chapter 10, Abbreviations. In this thesis, it was demonstrated that an increased Abeta42/Abeta40 ratio, but not a decreased Abeta42/Abeta40 ratio, induced upregulation of the retinoic acid binding protein CRABP1 on the transcript level and on the protein level. This, in turn, reduced the responsiveness of SH-SY5Y cells to retinoic acid, which reduced their differentiation potential. Knockdown of the increased CRABP1 levels by siRNA rescued the differentiation potential of these cells. These findings, in conjunction with known functional properties of CRABP1, suggest that up-regulated CRABP1 might, possibly also in vivo, prevent the terminal differentiation of neural precursor cells into functional neurons (disturbed neurogenesis). Furthermore, the phosphorylation status of proteins was determined providing further insights into signal transduction pathways. The IGF2/IGF1R/PKC together with the PI3K/AKT survival pathway was found to be inversely regulated by an altered Abeta42/Abeta40 ratio (IGF2, IGFBP5, PKC, AKT1). The chromosomal locus 11p15.5 was identified as a hot spot: an increased Abeta42/Abeta40 ratio, in contrast to a decreased one, down-regulated the IGF2-H19 imprinted region (chr.11p15.5) indicating that imprinting may play a role in AD. In consequence of an increased Abeta42/Abeta40 ratio, GSK3beta was hyperphosphorylated on the activating site Y216, and tau441 showed stronger phosphorylation on S199/S202, two sites reported to turn tau, upon phosphorylation, into a protein with possible toxic properties. APLP2 was found to be up-regulated as a consequence of an increased Abeta42/Abeta40 ratio, whereas APLP1 was up-regulated in response to a decreased Abeta42/Abeta40 ratio, indicating inverse Abeta-dependent regulation of APLP1/2 expression. In response to an increased Abeta42/Abeta40 ratio, expression levels of a set of genes were altered in such a way that a tendency towards faster blood coagulation and reduced fibrinolysis could be recognized on the transcript level (PLAT, TFPI2, FGB, SERPINF1, SERPINE2). This view is supported by observations in AD patients who have a greater risk of strokes and diminished cerebral perfusion. As Abeta-inducible candidate kinases possibly involved in tau-phosphorylation, DYRK1, CDKL1, CDKL5, CDK6, DCAMKL1, ERK1 and PFKP were identified due to their altered expression levels (or phosphorylation status for ERK1). Indeed, previous studies demonstrated that Abeta42 induces tau hyperphosphorylation in animal models. PFKP, which plays a key role in glycolysis, was found to be dysregulated in consequence of a changed Abeta42/Abeta40 ratio and could possibly reflect disturbed regulation of glucose and ATP metabolism in brains of AD patients. A potential function was assigned to the hitherto uncharacterized KIAA0125, namely to be a counter player of neurogenin 2, which was co-regulated with C99 and neuronatin. Furthermore, the following areas were distinctly affected by a changed Abeta42/Abeta40 ratio (for most genes determined on the transcript level and for some additionally on the protein level): Copper transport/metabolism with special regard to ATP7A, several (metallo) proteases (ADAMTS9, ADAMTS3, MMP8, PREP, ECEL1, CTSD, PRSS12), metalloprotease inhibitors (TIMP3, TIMP1), extracellular matrix proteins or related enzymes thereof (RELN, COL4A1, COL4A2, HS3ST2), cytoskeletal proteins (ACTA2, ACTN1), mitochondrial respiratory chain components (NDUFB9), cytochromes (b-561 and b-245), dopamine, serotonin and glutamate -metabolism with special regard to DDC, HMP19 and GAD1. Effects of BDNF (non-catalytic isoform of TRKB), membrane fusion of neurotransmitter containing vesicles (STX3A, SYN2), Ca2+ influx (AMPA2), acetylcholine receptors (CHRNA7), Notch signaling (DNER, TLE1, TLE2, JAG1, CUTL2), TGFbeta signaling (TGFB2, TGFBR2, BAMBI, BMP7), WNT signaling (DKK2, DKK4), G protein signaling (RGS4) and ERK/MEK signaling (ERK1, MEK1). Growth cone guidance, synaptogenesis and dendritic branching are expected to be impaired as consequence of an increased Abeta42/Abeta40 ratio but improved as a result of a decreased one (SEMA3A, SEMA3C, L1CAM, PTN, SLIT1). Further genes involved in the following areas were distinctly influenced by a changed Abeta42/Abeta40 ratio: Glutamate/ammonia metabolism (GLUL, GLS), urea cycle (ASS), cell cycle regulation (CCND1, CDKN1A), glucocorticoid regulated kinase (SGK), receptors (PTGER2, EGFR, AMPA2, AMPA3, GRM7, GRM8c, GLRB, GABRB3), long term potentiation (CREB1), axonal transport (DNCLI2), angiogenesis (HGF, VEGF), T-cell receptors and connected transcription factors (T-cell receptor alpha and delta locus, GATA3), lipoprotein associated proteins or adaptor proteins hereof (LRP4, PDZK1), vesicular transport of organelles and microtubule association (VMP), transcription factors (PBX1, SHOX2) and stress-related factors (ADRB1). Taken together, the identified genes, proteins and pathways have given new and deeper insight into the effects of different C99 cleavage products and they have provided new hypotheses for the pathological mechanisms of AD. Furthermore they are possible candidates for genetic risk factors and may be helpful in explaining the mechanisms of non-genetic risk factors. The gene expression pattern, specific for an increased Abeta42/Abeta40 ratio, could be useful, together with clinical data, for the diagnosis of AD. Finally, some of the identified transcripts, proteins and pathways might turn out to be suitable drug targets.

Translation of abstract (German)

Das humane Genom umfasst ca. 20.000-25.000 Gene. Die Gene, für die eine Beteiligung an der Alzheimer Krankheit (AK) bekannt ist, sind das Amyloid Precursor Protein (AbetaPP), Presenilin 1 (PS1), Presenilin 2 (PS2) und Apolipoprotein E (APOE). Es wird kontrovers diskutiert, welche weiteren Gene an der Ätiologie der AK beteiligt sind. C99, das C-terminale Spaltprodukt von AbetaPP, ist das direkte, in vivo vorkommende Vorläufer-Protein der Abeta-peptide. Es wird proteolytisch prozessiert, wobei verschiedene Abeta-peptide gebildet werden. Im Gegensatz zu der Form mit 40 Aminosäuren (Abeta40), die als physiologische Abeta-Form betrachtet wird, glaubt man von der Variante mit 42 Aminosäuren (Abeta42), dass es sich um die pathogene Form handelt, welche die pathophysiologische Kaskade der AK auslöst. Um verschiedene Abeta42 und Abeta40 Mengen zu bilden, wurden die Abeta-Vorläufer C99I45F und C99V50F (zwei C99-Mutanten, die dafür bekannt sind, verschiedene Abeta42 und Abeta40 Mengen zu bilden) in humanen Neuroblastomzellen überexprimiert. Daraus resultierten, in Folge variierender intrazellulärer Spaltung durch die gamma-Sekretase, unterschiedliche Abeta42- und Abeta40-Mengen und die miteinhergehende Bildung der entsprechenden intrazellulären Domänen (AICD). Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Einsichten in die pathologischen Mechanismen der AK als Konsequenz der veränderten C99-Spaltprodukte zu erhalten. Deshalb wurde die Reaktion der humanen Neuroblastomzellinie SH-SY5Y auf verschiedene, überexprimierende Abeta42/Abeta40 Mengen genomweit auf Transkriptom-Ebene (Affymetrix) und auf Proteom-Ebene untersucht. Wie zu erwarten war, wurde eine Vielzahl von Genen als differentiell exprimiert identifiziert, die zuvor in anderen Studien als AK-assoziiert gefunden wurden. Entscheidend war jedoch die Entdeckung weiterer Gene, für die bisher noch keine Verbindung zur AK hergestellt wurde. Hierdurch wurden neue Wechselwirkungen („Cross-Talk“) zwischen Genen/Proteinen ersichtlich. Die Gene, für die eine vorherrschende Rolle als Antwort auf veränderte C99 Spaltprodukte angenommen wird, sind in Klammern angegeben und deren vollständige Gennamen sind in Kapitel 10, Abkürzungsverzeichnis, zu finden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Retinsäure-bindende Protein CRABP1 in Folge eines erhöhten, jedoch nicht in Folge eines erniedrigten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses, auf Transkript- und Proteinebene heraufreguliert wurde. Dies wiederum erniedrigte die Ansprechbarkeit der SH-SY5Y Zellen auf Retinsäure, wodurch deren Differenzierungspotential reduziert wurde. „Knockdown“ des heraufregulierten CRABP1 stellte das Differenzierungspotential dieser Zellen wieder her. Diese Entdeckung, in Verbindung mit den bisher bekannten funktionellen Eigenschaften von CRABP1, könnte möglicherweise auch in vivo ein wichtiger Mechanismus sein, bei dem CRABP1 die terminale Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in funktionelle Neuronen verhindern könnte (gestörte Neurogenese). Weiterhin wurde der Phosphorylierungsstatus von Proteinen bestimmt, wodurch weitere Einsichten in Signaltransduktionswege ersichtlich wurden. Der IGF2/IGF1R/PKC- zusammen mit dem PI3K/AKT-Signaltrans-duktionsweg wurde durch ein verändertes Abeta42/Abeta40-Verhältnis invers reguliert (IGF2, IGFBP5, PKC, AKT1). Der chromosomale Lokus 11p15.5 wurde als „hot spot” identifiziert: ein erhöhtes Abeta42/Abeta40-Verhältnis, im Gegensatz zu einem erniedrigten, regulierte die „IGF2-H19 imprinted region“ (chr.11p15.5) herunter, was darauf hindeutet, dass genomische Prägung (Imprinting) bei der AK eine Rolle spielen könnte. In Folge eines erhöhten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses wurde GSK3beta an der aktivierenden Stelle Y216 hyperphosphoryliert und Tau441 zeigte stärkere Phosphorylierung an S199/S202 zwei Stellen, von denen angenommen wird, Tau durch Phosphorylierung, in ein Protein mit evtl. toxischen Eigenschaften zu überführen. APLP2 wurde in Folge eines erhöhten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses heraufreguliert, wohingegen APLP1 in Folge eines erniedrigten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses heraufreguliert wurde, was auf eine inverse, Abeta-abhängige Regulation von APLP1/2 hindeutet. Als Antwort auf ein erhöhtes Abeta42/Abeta40-Verhältnis änderte sich die Expression einer Gruppe von Genen so, dass eine Tendenz zu schnellerer Blutgerinnung, bei gleichzeitig verlangsamter Fibrinolyse (PLAT, TFPI2, FGB, SERPINF1, SERPINE2) auf Transkriptebene zu erkennen war. Diese Sichtweise wird durch Beobachtungen an Alzheimer Patienten unterstützt, die ein größeres Risiko für Schlaganfälle und verminderte cerebrale Durchblutung aufweisen. Als Abeta-induzierbare Kandidaten für Kinasen, die Tau phosphorylieren könnten, wurden DYRK1, CDKL1, CDKL5, CDK6, DCAMKL1, ERK1 und PFKP identifiziert, für die veränderte Expressionswerte (oder ein veränderter Phosphorylierungsstatus für ERK1) gefunden wurden. In der Tat haben vorhergehende Studien gezeigt, dass Abeta42 Tau-Hyperphosphorylierung in Tiermodellen induziert. PFKP, ein Schlüsselenzym der Glykolyse, wurde in Folge eines veränderten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses unterschiedlich reguliert und könnte möglicherweise einen gestörten Glukose- und ATP-Metabolismus in Gehirnen von AK-Patienten widerspiegeln. Dem bisher uncharakterisierten KIAA0125 wurde die mögliche Funktion zugewiesen, ein Gegenspieler von Neurogenin 2 zu sein, welches mit C99 und Neuronatin als gemeinsam reguliert identifiziert wurde. Weiterhin wurden folgende Bereiche durch ein verändertes Abeta42/Abeta40-Verhältnis deutlich beeinflusst (für die meisten Gene auf Transkriptebene bestimmt und für manche zusätzlich auf Proteinebene): Kupfertransport/Kupferstoffwechsel mit speziellem Hinblick auf ATP7A, verschiedene (Metallo)proteasen (ADAMTS9, ADAMTS3, MMP8, PREP, ECEL1, CTSD, PRSS12), Metalloproteaseinhibitoren (TIMP3, TIMP1), extrazelluläre Matrixproteine oder hiermit verwandte Enzyme (RELN, COL4A1, COL4A2, HS3ST2), Proteine des Zytoskeletts (ACTA2, ACTN1), Komponenten der mitochondrialen Atmungskette (NDUFB9), Zytochrome (b-561 und b-245), Dopamin-, Serotonin- und Glutamatstoffwechsel mit spezieller Hinsicht auf DDC, HMP19 and GAD1. Effekte durch BDNF (nicht-katalytische TRKB-Isoform), Membranfusionen von Neurotransmitter-enthaltenden Vesikeln (STX3A, SYN2), Ca2+-Einstrom (AMPA2), Azetylcholinrezeptoren (CHRNA7), Notch-Signalweg (DNER, TLE1, TLE2, JAG1, CUTL2), TGFbeta-Signalweg (TGFB2, TGFBR2, BAMBI, BMP7), WNT-Signalweg (DKK2, DKK4), G-Protein-Signalweg (RGS4) und ERK/MEK-Signalweg (ERK1, MEK1). Die Orientierung axonaler Wachstumskegel, die Synaptogenese und die Tendenz dendritische Verzweigungen zu bilden, waren auf Transkriptebene in Folge eines erhöhten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses vermindert, aber als Resultat eines erniedrigten Abeta42/Abeta40-Verhältnisses verstärkt (SEMA3A, SEMA3C, L1CAM, PTN, SLIT1). Deutlich beeinflusst durch ein verändertes Abeta42/Abeta40-Verhältnis waren Gene, die an folgenden Bereichen beteiligt waren: Glutamat/Ammoniak Stoffwechsel (GLUL, GLS), Harnstoff-Zyklus (ASS), Zellzyklusregulation (CCND1, CDKN1A), Glukokortikoid regulierte Kinase (SGK), Rezeptoren (PTGER2, EGFR, AMPA2, AMPA3, GRM7, GRM8c, GLRB, GABRB3), Langzeitpotenzierung (CREB1), axonaler Transport (DNCLI2), Angiogenese (HGF, VEGF), T-Zellrezeptoren und assoziierte Transkriptionsfaktoren (T-Zellrezeptor alpha und delta Lokus, GATA3), Lipoprotein-assoziierte Proteine oder Adapterproteine hiervon (LRP4, PDZK1), vesikulärer Organellen Transport und Mikrotubuli Assoziation (VMP), Transkriptionsfaktoren (PBX1, SHOX2) und stressverwandte Faktoren (ADRB1). Zusammengefasst haben die identifizierten Gene, Proteine und Signal-transduktionswege neue und tiefere Einblicke in die Effekte veränderter C99-Spaltprodukte gewährt and stellen neue Hypothesen für die pathologischen Mechanismen der Alzheimer Krankheit zur Verfügung. Weiterhin sind sie mögliche Kandidaten für genetische Risikofaktoren und könnten dabei hilfreich sein, Mechanismen nicht-genetischer Risikofaktoren zu erklären. Das für ein erhöhtes Abeta42/Abeta40-Verhältnis spezifische Genexpressionsmuster könnte, zusammen mit klinischen Daten, für die Diagnose der AK nützlich sein. Letztendlich könnten sich einige der identifizierten Transkripte, Proteine und Signalwege als geeignete Angriffsstellen für Medikamente erweisen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Beyreuther, Prof. Dr. Konrad
Date of thesis defense: 28 May 2008
Date Deposited: 26 Jun 2008 10:00
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: DNS-Chip, Genexpression, Alzheimer-Krankheit
Uncontrolled Keywords: Normalisierungsalgorithmen , ProteinphosphorylierungGene expression profiling
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