English Title: The Role of Phosphorylation of the negative Element FREQUENCY in the Circadian Clock of Neurospora crassa

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Abstract

Die circadianen Uhren von Eukaryoten bestehen aus Proteinen, deren Zusammenspiel vernetzte positive und negative Rückkopplungsschleifen erzeugt. Diese steuern metabolische und physiologische Funktionen sowie das Verhalten der Organismen in einem robusten Rhythmus, der ungefähr der 24-stündigen Erdrotation entspricht. In der Uhr von Neurospora crassa, aktiviert der heterodimere Transkriptionsfaktor WHITE COLLAR-Komplex (WCC) als positives Element das Gen seines negativen Regulators, frequency (frq). Das Protein FREQUENCY (FRQ) rekrutiert Casein-Kinase 1a (CK-1a) und vermittelt die Phosphorylierung des WCC, wodurch dieser inaktiviert wird. FRQ selbst wird im Verlauf eines circadianen Tages hyperphosphoryliert und abgebaut. Dadurch wird die Inaktivierung von WCC aufgehoben und ein neuer Zyklus beginnt. FRQ wird im Verlauf einer circadianen Periode an mehr als 75 Stellen phosphoryliert. Die genaue Funktion dieser hohen Anzahl an Phosphorylierungen ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FRQ eine zweiteilige Bindestelle für Casein-Kinase 1a (CK-1a) enthält, die von zwei kurzen Segmenten, FCD1 und FCD2, gebildet wird. FCD1 ist in der basischen N-terminalen Domäne von FRQ lokalisiert, während FCD2 im sauren Mittelteil des Proteins liegt. Beide Segmente werden für eine stabile Interaktion von CK1a mit FRQ benötigt. Des Weiteren weisen die gesammelten Daten darauf hin, dass durch Interaktion des basischen, positiv geladenen N-Terminus von FRQ mit dem negativ geladenen Rest des Proteins FCD1 und FCD2 in räumliche Nähe zueinander gebracht werden und so eine Bindestelle für CK-1a generiert wird. Durch fortschreitende,CK-1a-vermittelte Phosphorylierung des N-Terminus im Laufe eines circadianen Tages wird die elektrostatische Interaktion von N-Terminus und restlichem Protein immer schwächer und damit auch die Interaktion von FRQ und CK-1a. Einhergehend damit verliert FRQ mit fortschreitender Hyperphosphorylierung zunehmend die Fähigkeit, die CK1-abhängige Inaktivierung des WCC zu vermitteln. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen so einen Mechanismus auf, wie die Interaktion von CK-1a mit FRQ im Laufe eines circadianen Tages reguliert wird.

Translation of abstract (English)

Eukaryotic circadian clocks are comprised of proteins functioning together to produce a network of positive and negative feedback loops. These control a multitude of different metabolical, physiological and behavioral functions in a robust rhythm mimicking the 24-hour rhythm of the earth rotation. In the circadian feedback loop of Neurospora crassa, the heterodimeric transcription factor WHITE COLLAR complex (WCC) as the positive element activates the gene of its negative regulator, frequency (frq). FREQUENCY (FRQ) recruits CASEIN KINASE 1a (CK-1a) and mediates the phosphorylation of WCC, thereby inactivating it. FRQ is hyperphosphorylated and degraded over the course of the circadian day, thereby abrogating the inhibition of WCC so that the cycle starts again. FRQ itself is phosphorylated during the circadian period at more than 75 sites. The functions of most of these phosphorylations are not known in detail. In this work it could be shown that FRQ contains a bipartite binding site for CK-1a, consisting of two short segments, FCD1 and FCD2. FCD1 is located in the basic N-terminal part of FRQ, while FCD2 is located in the acidic middle domain. Both segments are necessary for stable interaction with CK-1a. Further data hint at the possibility that FCD1 and FCD2 are brought into close contact by interaction of the basic, positively charged N-terminal part with the acidic, negatively charged middle domain of FRQ, thereby forming a binding site for CK-1a. CK-1a-mediated phosphorylation of the FRQ N-terminus in the course of a circadian day weakens the ionic interaction of N-terminus and middle part of FRQ, which also leads to the weakening of the FRQ-CK-1a interaction. Hyperphosphorylated FRQ thereby loses its ability to mediate the CK-1a dependent inactivation of WCC. The results of this work propose a mechanism by which the interaction of FRQ and CK-1a is regulated in the course of the circadian day.