PDF, English - main document Download (14MB) | Terms of use

Abstract

Since in trypanosomes most protein-coding genes are constitutively transcribed by RNA polymerase II in a polycistronic manner, gene expression is mainly regulated at the post-transcriptional level. It is therefore interesting to investigate the relevant regulatory factors. In a previous genome-wide tethering screen hundreds of putative mRNA-fate regulators were found, including the proteins BFR1L, an up-regulator of gene expression, and ZC3H5, a down-regulator of gene expression. BFR1L has some similarities to yeast Bfr1p, an ER- and polysome-associated protein. BFR1L displays in vivo mRNA binding although it lacks canonical RNA-binding domains. Double-knockout bloodstream form trypanosomes displayed a slight growth defect. By immunofluorescence microscopy, a tagged version was located in the cytoplasm and overlapped partially with an ER marker. RNA pull-down analysis suggested that most of the BFR1L-bound mRNAs encode ribosomal proteins, but no common RNA motif could be found by in silico analysis. The mRNAs encoding ribosomal proteins are known not to sequester in granules upon starvation stress or heat shock. Similarly, BFR1L protein did not go to granules under starvation stress. It is tempting to speculate that the interaction remains active during stress, and targeting of the mRNAs to the ER could prevent sequestration into granules and could keep the mRNAs in ribosomes. The attachment of BFR1L to the ER could be mediated via the putative interaction partner Tb927.9.9550, which has a transmembrane domain. ZC3H5 knock-down led to a fast growth defect, killing the cells after 48 h of RNAi induction. We therefore analyzed the RNAi effect on growth kinetics, protein levels, nuclei/kinetoplasts ratios and the transcriptome at different time points. After RNAi induction, the proportion of 2N2K cells increased rapidly. In addition, the ZC3H5 RNAi cells often possessed abnormal and higher numbers of nuclei and kinetoplast. While short-term down-regulation of ZC3H5 showed only a minor effect with respect to the transcriptome, an increase of mRNAs encoding ribosomal proteins, the increase of the monosomal peak without an increase of mRNAs in this fraction, the occurrence of half-mers as well as an increase of mRNAs encoding ribosomal proteins in the free fraction were observed with respect to the polysomal profiles. This suggest that the ribosome assembly is disturbed upon knock-down of ZC3H5. However, this seems to be a secondary effect. RNA pull-down analysis suggested that ZC3H5 binds mRNAs encode cytoskeleton proteins. Tandem Affinity Purification of ZC3H5 followed by MS analysis revealed three putative interaction partners which were validated by co-immunoprecipitation (Tb927.8.1500, Tb927.7.3040 and Tb927.11.4900). In addition, tethering of ZC3H5 and its interaction partners to a CAT reporter showed that the proteins are repressors; thus, we have identified a novel repressor complex that may regulate genes required for cell cycle progression. The exact mechanism of action is not known at the moment, but it is tempting to speculate that the function of Tb927.11.4900 as a G protein is responsible for the association and dissociation of the complex. This could be cell cycle dependent, because the target mRNAs peak in S-phase. Maybe the ZC3H5 complex represses its targets during the rest of the cell cycle and targets are de-repressed in S-phase to produce the proteins needed for cytokinesis.

Translation of abstract (German)

In Trypanosomen werden die meisten Protein-kodierenden Gene konstitutiv durch die RNA Polymerase II transkribiert. Deswegen wird die Genexpression hauptsächlich durch post-transkriptionelle Mechanismen reguliert, was die Untersuchung relevanter regulatorischer Faktoren interessant macht. In einem vorangegangenen „tethering screen“ wurden hunderte mögliche Regulatoren identifiziert, einschließlich BFR1L, welches die Gen-expression hochreguliert, und ZC3H5, welches die Geneexpression herunterreguliert. BFR1L hat Ähnlichkeiten zu dem Hefeprotein Bfr1p, welches mit dem ER und Polysomen assoziiert. BFR1L kann in vivo an mRNA binden, obwohl es keine kanonische RNA-bindende Domäne besitzt. Das Ausschalten von BFR1 in der Blutstromform von Trypanosomen führt zu einem leichten Wachstumsdefekt. Per Immunfluoreszenz-mikroskopie konnte gezeigt werden, dass sich BFR1L im Zytoplasma befindet und teilweise mit einem ER-Marker überlappt. RNA Pull-Down Analysen deuten darauf hin, dass BFR1L hauptsächlich mit mRNAs, welche für ribosomale Proteine kodieren, interagiert. Mittels in silico-Analyse konnte jedoch kein übereinstimmendes RNA-Motiv unter den präferenziell gebundenen mRNAs gefunden werden. mRNAs, die für ribosomale Proteine kodieren, sind bekannt dafür, dass sie nicht in Stress- oder Hitzeschock-induzierten Granula akkumulieren. Ebenso befindet sich BFR1L unter Stressbedingungen nicht in diesen Granula. Daher wird vermutet, dass die Interaktion zwischen BFR1L und seinen interagierenden mRNAs auch unter Stressbedingungen aktiv bleibt, BFR1L die mRNAs zum ER rekrutiert und somit die Akkumulierung der mRNAs in Stressgranula verhindern könnte. Die Bindung von BFR1L zum ER könnte durch den möglichen Interaktionspartner Tb927.9.9550, welcher eine Transmembrandomäne hat, vermittelt werden. Das Herunterregulieren von ZC3H5 führte zu einem rapiden Wachstumsdefekt, was die Zellen innerhalb von 48 Stunden tötet. Es konnte festgestellt werden, dass die Menge an Zellen mit 2 Nuklei und 2 Kinetoplasten nach der Herunterregulierung rapide anstieg und die Zellen oft generell eine erhöhte Anzahl an Nuklei und Kinetoplasten besaßen. Das Transkriptom zeigte bei kurzzeitiger Herunterregulierung von ZC3H5 einen Anstieg von mRNAs, welche für ribosomale Protein kodieren, und wurde ansonsten kaum beeinflusst. Hinsichtlich des Polysomen Profils konnte ein Anstieg der Monosomendichte, jedoch ohne gleichzeitigen Anstieg der mRNA Menge in dieser Fraktion, das Auftreten von „half-mers“ und dem Anstieg von mRNAs, welche für ribosomale Proteine kodieren, in der freien Fraktion beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass es ich um einen Defekt in der Zu-sammensetzung von Ribosomen handelt, was vermutlich ein sekundärer Effekt ist. Eine RNA-Pull-Down Analyse zeigte, dass ZC3H5 mit mRNAs interagiert, welche für Proteine des Zytoskeletts kodieren. Tandem-Affinitätsaufreinigung gefolgt von massenspektro-metrischer Analyse konnte eine Interaktion von ZC3H5 mit drei potentiellen Proteinen zeigen (Tb927.8.1500, Tb927.7.3040 und Tb927.11.4900). Außerdem konnte gezeigt werden, dass alle vier Proteine die Genexpression eines Reporters herunterregulieren. Dies zeigt, dass ein neuer repressiver Komplex identifiziert wurde, welcher eventuell Gene reguliert, die eine Rolle im Fortschreiten des Zellzyklus spielen. Es wird vermutet, dass die Funktion von Tb927.11.4900 als G-Protein für die Assoziation und Dissoziation des Komplexes verantwortlich ist. Dies könnte abhängig vom Zellzyklus passieren, da die mRNAs, welche mit ZC3H5 interagieren, vermehrt in der S-Phase zu finden sind. Eventuell hemmt der ZC3H5-Komplex die mRNAs während des restlichen Zellzyklus, doch während der S-Phase, wenn der Komplex dissoziiert, können die mRNAs translatiert werden und die Proteine, welche für die Zytokinese benötigt werden, werden produziert.