English Title: Characterisation of the Peroxisomal ARF-Binding

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Abstract

Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war bekannt, daß ARF (ADP-Ribosylierungsfaktor) zusammen mit Coatomer an isolierte Peroxisomen der Rattenleber bindet. Darauf aufbauend wurde zunächst gezeigt, daß die ARF-Bindung für Peroxisomen spezifisch ist und von einer Behandlung der Tiere mit Peroxisomenproliferatoren abhängt. Von den sechs bei Säugern bekannten ARF-Isoformen konnten ARF1 und ARF6 an der Peroxisomenmembran identifiziert werden. Funktionelle Studien zeigten, daß ARF1 nicht jedoch ARF6 für die Rekrutierung von Coatomer an Peroxisomen essentiell ist. Dabei modulieren ATP und Faktoren aus dem Cytosol in synergistischer Weise insbesondere die ARF1-Rekrutierung. Zudem lieferten Experimente in flottierenden Nycodenzgradienten in vitro Hinweise zur ARF- und Coatomer-abhängigen Generierung einer zusätzlichen peroxisomalen Population. Die in vivo-Relevanz wurde am Modell der Hefe S. cerevisiae mit ARF- und Coatomer-mutanten untersucht. Die oleatinduzierte Proliferation der Peroxisomen konnte dabei durch inaktiven Coatomer oder funktionsloses ARF1 inhibiert werden. Demgegenüber führte die Deletion von ScARF3, dem Hefe-Homologen des Säuger-ARF6, zu einer verstärkten Proliferation unter Oleat. Neben der ARF1/Coatomer-abhängigen Bildung peroxisomaler Vesikel scheint ein zweiter Mechanismus der Peroxisomenvermehrung zu existieren. An ihm könnten neben Pex11?p auch Komponenten des Aktincytoskeletts beteiligt sein. So konnte in der vorliegenden Arbeit das Aktin-bindende Myosin MYH9 an einer durch ATP generierten peroxisomalen Subpopulation identifiziert werden. Des weiteren zeigen Arbeiten anderer Gruppen eine Beteiligung des Dynamin-ähnlichen Proteins DLP-1 an einem späteren Stadium der peroxisomalen Teilung. So führt die Deletion von DLP-1 in Zusammenhang mit Pex11?p-Expression zur Ausbildung tubulärer Peroxisomen. Eigene Befunde zeigen nach Expression von Pex11?p-Varianten ebenfalls die Ausbildung von Tubuli, die darüber hinaus gepaart sind mit einer atypischen Segregation von peroxisomalen Membran-proteinen. Ähnliche Membranveränderungen in Form von Perlenschnüren mit ausgeprägten Konstriktionen ließen sich auch durch Gabe von Peroxisomenproliferatoren in der Rattenleber induzieren. All diese Befunde, die zu einer Bildung von Tubuli führen, implizieren eine verhinderte Teilung der Peroxisomen. Aus den vorgestellten Daten lassen sich zwei Modelle entwickeln, die eine Coatomer-abhängige und eine Coatomer-unabhängige Vesikulierung der Peroxisomenmembran beschreiben. Dabei kann letzterer Prozeß als dreistufige Sequenz aus (i) Segregation von Membranproteinen, (ii) Ausbildung von Konstriktionen und (iii) Cytoskelett/DLP-1-vermittelter Membranabschnürung betrachtet werden. Zusammen mit jüngsten eigenen Beobachtungen, die eine Steuerung des peroxisomalen Phosphoinositid-Metabolismus durch ARF und Komponenten des Cytosols zeigen, weisen die hier vorliegenden Unter-suchungen der kleinen GTPase ARF bei den membrandynamischen Prozessen innerhalb der Vesikulierung von Peroxisomen eine zentrale Rolle zu.

Translation of abstract (English)

At the beginning of the present work, unspecified binding of both ARF (ADP-ribosylation factor) and coatomer to isolated rat liver peroxisomes was known. Based on these data, it was shown that ARF-binding to peroxisomes is specific and depends on treating the animals with peroxisome proliferators. Out of the six ARF-isoforms known in mammals both ARF1 and ARF6 are bound to the peroxisomal membrane. According to functional studies, ARF1 but not ARF6 is essential for recruiting coatomer to peroxisomes. Moreover, the ARF1-binding is modulated by ATP and cytosolic factors that both act in a synergistic manner. In addition, flotation experiments in nycodenz gradients provided evidence for the ARF- and coatomer- dependent generation of a new peroxisomal population in vitro. The in vivo relevance of peroxisomal ARF/coatomer binding was studied in the yeast S.cerevisiae as a model system using ARF and coatomer mutants, respectively. The oleate induced proliferation of peroxisomes was inhibited by functional inactivated ARF1 and coatomer. In contrast, the deletion of ScARF3, the yeast homolog of mammalian ARF6, resulted in a remarkable increase in proliferation of peroxisomes. Beside the ARF1/coatomer-dependent formation of peroxisomal vesicles, there is evidence for a second mechanism of peroxisomal propagation involving both Pex11?p and components of the actin cytoskeleton. In the present study, myosin MYH9, an actin binding protein, was identified in a subpopulation of peroxisomes that was generated in an ATP-dependent manner. In line with this observation, others have shown the involvement of the dynamin-like protein 1 (DLP-1) acting in a later step of peroxisomal fission. Deleting DLP-1 function in a Pex11?p overexpressing background caused peroxisomes to tubulate. Own studies, expressing a tagged Pex11?p demonstrated formation of peroxisomal tubuli accompanied by an atypical segregation of peroxisomal membrane proteins. A similar phenotype could be induced in rat livers by distinct peroxisome proliferators revealing peroxisomal constrictions that resembled pearls on a string. According to the presented data, two models of peroxisomal vesiculation, a coatomer-dependent and a coatomer-independent one, were deduced. The latter consists of a three-step procedure comprising (i) segregation of membrane proteins, (ii) formation of constrictions, and (iii) cytoskeleton/DLP-1 mediated fisson of the membrane. In the light of our recent observations, that ARF and cytosolic components regulate peroxisomal phosphoinositide metabolism, the presented data attribute a central role in peroxisome biogenesis to the small GTPase ARF.