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Abstract

Facultatively intracellular pathogens adapt to and rewire host defenses to induce infection and promote survival and proliferation. Salmonella enterica serovar Typhimurium (STm) injects effector proteins via two Type 3 secretion systems into the host cytoplasm to usurp host cell machineries. Hence, investigating protein-protein interactions at the host-pathogen interface is essential for gaining a deeper insight into the interdependency between Salmonella and their host during infection. While more than 30 translocated effectors have been described, knowledge about their function during infection remains incomplete, and the number of proteins that are secreted during infection is likely underestimated.

In this work, l demonstrate the identification of interaction partners of known translocated effectors, maintaining the infection context and without relying on ectopic expression. The Affinity Purification Quantitative Mass Spectrometry (AP/QMS) workflow that I describe in this thesis bridges the gap between large-scale proteomics and high physiological relevance. In the process, I highlight, validate and characterize interactions occurring at endogenous levels of effector secretion. Many bacterial effector proteins displayed promiscuity and multifunctionality by targeting different host processes. Additionally, I assess effector convergence on distinct host processes, as well as effector cooperation and physical effector- effector interaction. These concepts are of groundbreaking importance to better understanding the reprograming of host pathways in different host backgrounds.

I identify cholesterol transport as a convergence point for multiple effector proteins and assess the impact of the involved effectors and targeted host proteins on cholesterol accumulation at the Salmonella-containing vacuole. In addition, I demonstrate that the Salmonella effector SteC is able to directly bind and phosphorylate formin-like proteins, thereby providing a missing link regarding the method by which Salmonella induces cytoskeletal rearrangements during infection. Furthermore, I describe an arrayed STm knockout screen in an infection context, relying on high-throughput microscopy and unbiased image feature extraction. This is used to showcase bacterial processes that are essential for infection and to predict a novel secreted effector protein, YebF, based on its feature fingerprint.

In conclusion, the work presented in this thesis provides the infection biology research community with a rich dataset of novel effector-target interactions, an adaptable and validated AP/QMS workflow, and a well-characterized strain collection for the identification of protein- protein interactions at the pathogen-host interface. Additionally, a database of unbiased phenotypic fingerprints obtained from high-throughput microscopy will be invaluable for the prediction of novel effector proteins and the dissection of host-pathogen interconnectivity. The multifaceted systems biology approach to Salmonella infection presented in this study will fuel hypothesis-driven research and provides a decisive step towards a holistic understanding of the host-pathogen interface.

Translation of abstract (German)

Fakultativ intrazelluläre Pathogene passen sich den Verteidigungsmechanismen ihres Wirtes an und vernetzen diese neu, um eine Infektion auszulösen und ihr Überleben und ihre Vermehrung zu begünstigen. Salmonella enterica serovar Typhimurium (STm) injiziert mittels zweier Typ 3 Sekretionsapparate Effektorproteine in das Zytoplasma des Wirtes, um dort Proteinkomplexe neu zu verschalten. Daher ist die Untersuchung der Protein-Protein Interaktionen an der Schnittstelle zwischen Wirt und Pathogen essentiell, um ein genaueres Bild der Wechselbeziehungen zwischen Salmonellen und ihrem Wirt zu erlangen. Obwohl mehr als 30 sekretierte Effektorproteine beschrieben wurden, bleibt das Wissen über ihre Funktion im Verlauf der Infektion unvollständig. Außerdem ist die Anzahl der während der Infektion sekretierten Proteine höchstwahrscheinlich unterschätzt.

In dieser Arbeit stelle ich die Identifizierung von Interaktionspartnern bekannter, sekretierter Effektorproteine im Infektionskontext und ohne ektopische Expression dar. Die Methodik aus Affinitätsreinigung, gekoppelt an quantitative Massenspektrometrie (AP/QMS), die ich hier beschreibe, schlägt eine Brücke zwischen großskaliger Proteomik und hoher physiologischer Relevanz. Im Zuge dessen identifiziere, validiere und charakterisiere ich Protein-Protein Interaktionen, die bei endogenen Mengen an sekretiertem Effektorprotein auftreten. Viele der bakteriellen Effektoren zeigten ein promiskuitives Bindeverhalten und Multifunktionalität, da sie verschiedene Wirtsprozesse beeinflussten. Außerdem beleuchte ich die Konvergenz von Effektoren auf bestimmte Wirtsprozesse, sowie Effektor-Kooperation und Interaktionen zwischen Effektorproteinen. Diese Konzepte sind von grundlegender Wichtigkeit für ein besseres Verständnis der Umprogrammierung von Signalwegen des Wirtes in verschiedenen Wirtsystemen.

Ich identifiziere den Transport von Cholesterin als Konvergenzpunkt mehrerer Effektorproteine und untersuche die Rolle der involvierten Effektoren und Wirtsproteine in der Ansammlung von Cholesterin in der Replikationsnische der Salmonellen. Außerdem zeige ich, dass das Effektorprotein SteC Proteine der „Formin-like“ Familie direkt binden und phosphorylieren kann. Dadurch schließe ich ein fehlendes Bindeglied im Verständnis, wie Salmonellen das Zytoskelett ihres Wirtes verändern. Darüber hinaus beschreibe ich ein Deletionsmutanten- Screening im Infektionskontext, das auf Hochdurchsatzmikroskopie und unverzerrter Extraktion von Bildmerkmalen beruht. Im Zuge dessen beleuchte ich Prozesse im Bakterium, die essentiell für die Infektion sind und identifiziere ein neues sekretiertes Effektorprotein, YebF, auf Grund der Ähnlichkeit der Bildmerkmale zu bekannten Effektoren.

Zusammenfassend stellt die hier präsentierte Arbeit der infektionsbiologischen Forschungsgemeinschaft einen reichhaltigen Datensatz neuer Protein-Protein Interaktionen zwischen bakteriellen Effektoren und den Zielproteinen des Wirtes, eine vielseitige und validierte AP/QMS Methodik, sowie eine gut charakterisierte Sammlung an Salmonellenstämmen für die Identifikation von Protein-Protein Interaktionen an der Schnittstelle zwischen Wirt und Pathogen zur Verfügung. Außerdem ist die vorgestellte Datenbank aus unverzerrten, phänotypischen Merkmalen von unschätzbarem Wert für die Bestimmung neuer Effektorproteine und die Entschlüsselung der Vernetzung zwischen Wirt und Pathogen. Der facettenreiche, systembiologische Ansatz, mit dem die Salmonelleninfektion in dieser Arbeit beleuchtet wurde, wird die hypothesengetriebene Forschung vorantreiben und stellt einen maßgebenden Schritt hin zu einem holistischeren Verständnis der Schnittstelle zwischen Wirt und Pathogen dar.