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Abstract

Breast carcinoma is the leading cause of cancer-related death in women worldwide. The most common breast cancer subtype is Luminal A. Most patients with this subtype initially respond well to standard endocrine therapies. However, many of them develop metastasis years later. It is well-known that the tumor microenvironment (TME) plays an important role in supporting tumor progression. A major component of the TME are the cancer-associated fibroblasts (CAFs), which have been reported to have multiple tumor-promoting functions. The exact mechanisms though are still under investigation, and no successful anti-CAF therapies have been discovered yet. In my PhD studies, presented in this thesis, I investigated the role of CAFs in Luminal A breast cancer progression. To this end, I utilized CAFs isolated from Luminal A patient biopsies, as well as the classical in vitro models of Luminal A breast cancer – the MCF7 and T47D cell lines. In the TME, CAFs are exposed to many factors that activate them and drive them into a tumor-promoting phenotype. Previously, it has been shown that the combination of TNFα and TGFβ1 was sufficient to confer CAF-like properties on CAF precursor cells. Therefore, to mimic CAF activation in vitro, I stimulated the CAFs with these two cytokines. To study how the cytokine-activated CAFs could support breast cancer progression, the effect of CAF-conditioned medium (CM) on migration, autophagy and recovery post chemotherapy was examined in MCF7 and T47D cells. The goal was to identify novel CAF-secreted factors and/or signaling pathways that they activate in the breast cancer cells to support Luminal A relapse. To this aim, via mass spectrometry analysis, I studied the effect of the stimulation on the CAF secretome and full proteome. In addition, utilizing RNA sequencing, I investigated the effect of the cytokine-activated CAF CM on the MCF7 cells, and compared it to the effect of the CM from unstimulated CAFs. Finally, I compared the results from both analyses to better understand the complex crosstalk between CAFs and Luminal A breast cancer cells and how it could contribute to Luminal A breast cancer progression. First, I demonstrated that the stimulation with TNFα was sufficient to induce the CAFs to secrete factors with pro-migratory effect on the Luminal A cells. Second, I was able to identify upregulation of STAT/IFNβ1 signaling in the CAFs in response to the TNFα stimulation. In addition, the CAFs were able to relay the STAT signaling to the breast cancer cells via secretion of IFNβ1. Third, I identified STAT2 to work in a STAT1-independent manner as the transcription factor necessary for the TNFα-stimulated induction of the ISG (interferon-stimulated gene) signature in the CAFs. Although I could not show a clear connection between the CAF interferon signaling and the breast cancer migratory phenotype, the stimulation with TNFα appeared to potentially impede with the CAFs ability to support Luminal A recovery post chemotherapy. Thus, TNFα seemed to play a double role in the complex CAF-Luminal A crosstalk. While TNFα-stimulated CAFs secreted factors, which increased Luminal A breast cancer migration, some of these factors and/or even TNFα itself seemed to prevent the recovery of the tumor cells after chemotherapy. Further investigation of the complex CAF-Lum A crosstalk and the role of TNFα in it is necessary. Meanwhile the role of TNFα as a double-edge sword in the TME-cancer crosstalk is something to consider when deciding on the next best therapeutic option for treatment of refractory Luminal A breast cancer.

Translation of abstract (German)

Brustkrebs stellt weltweit die häufigste Ursache für krebsbedingte Tode unter Frauen dar. Der am häufigsten festgestellte Subtyp von Brustkrebs ist Luminal A. Die meisten Patientinnen mit diesem Subtyp profitieren zunächst von der gängigen endokrinen Therapie. Allerdings entwickeln viele der Patientinnen Jahre später Metastasen. Es ist bekannt, dass die Tumor-Mikroumgebung (TME) eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielt. Einen Hauptbestandteil der TME bilden die Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), welchen vielseitige tumorfördernde Funktionen zugeschrieben werden. Die genauen Mechanismen hierfür werden allerdings noch untersucht, und es wurden bislang keine erfolgreichen anti-CAF Therapien entwickelt. In meiner Doktorarbeit habe ich die Rolle von CAFs in der Progression von Brustkrebs des Luminal A Subtyps untersucht. Hierfür habe ich nebem den klassischen in vitro Modellen für Luminal A Brustkrebs – den Zellinien MCF7 und T47D – CAFs verwendet, die aus Biopsien von Luminal A Tumoren gewonnen worden sind. In der TME sind die CAFs einer Vielzahl an Faktoren ausgesetzt, die die CAFs aktivieren und damit in einen tumorförderlichen Phänotyp überführen können. Es wurde zuvor gezeigt, dass eine Kombinationsbehandlung mit TNFα und TGFβ1 ausreichend war, um in CAF-Vorläuferzellen einen CAF-ähnlichen Phänotyp zu induzieren. Aus diesem Grund habe ich CAFs mit diesen beiden Zytokinen stimuliert, um die Aktivierung der CAFs in vitro nachzustellen. Um zu untersuchen, wie die aktivierten CAFs die Progression von Brustkrebs beeinflussen können, wurden die Auswirkungen von CAF-konditioniertem Medium auf Migration, Autophagie und die Erholung nach einer Chemotherapiebehandlung in MCF7 und T47D Zellen untersucht. Dabei war es das Ziel, neue Faktoren zu identifizieren, die von den CAFs ausgeschüttet werden und die Signalwege zu untersuchen, die durch diese Faktoren in den Brustkrebszellen aktiviert werden und potentiell zu erneutem Tumorwachstum in Luminal A Patientinnen führen können. Hierfür habe ich mittels Massenspektrometrie den Effekt der Stimulation auf das CAF Sekretom und das CAF Proteom untersucht. Zusätzlich habe ich mittels RNA Sequenzierung den Effekt der durch Zytokine aktivierten CAFs auf das Transkriptom von MCF7 Zellen im Vergleich zu unstimulierten CAFs quantifiziert. Zuletzt habe ich die Ergebnisse beider Analysen vergleichen, um das komplexe Zusammenspiel zwischen CAFs und den Luminal A Brustkrebszellen und dessen Beitrag zur Progression der Krankheit besser zu verstehen. Zuerst habe ich gezeigt, dass die Stimulation mit TNFα ausreichend war, um die CAFs zur Ausschüttung von Faktoren mit migrationsförderlicher Wirkung auf die Luminal A Zellen anzuregen. Zweitens war ich in der Lage, die Aktivierung des STAT/IFNβ1 Signalwegs in den CAFs als Reaktion auf die Stimulation mit TNFα zu identifizieren. Zudem waren die CAFs in der Lage, durch Sekretion von IFNβ1 den STAT Signalweg auch in den Brustkrebszellen zu induzieren. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass STAT2 die durch TNFα induzierte Expression der interferon-stimulierten Gensignatur in den CAFs unabhängig von STAT1 vermittelte. Obwohl ich keine klare Verbindung zwischen der Aktivierung des Interferon-Signalwegs in den CAFs und dem migratorischen Phänotyp in den Brustkrebszellen aufzeigen konnte, schien die Stimulation mit TNFα die Fähigkeit der CAFs zu beeinträchtigen, die Erholung von Luminal A Brustkrebszellen nach einer Chemotherapiebehandlung voranzutreiben. TNFα scheint also eine duale Rolle im komplexen Zusammenspiel zwischen CAFs und Brustkrebszellen zu spielen. Während TNFα-stimulierte CAFs Faktoren ausschütteten, welche die Migration von Luminal A Brustkrebszellen verstärkten, schienen einige dieser Faktoren und/oder TNFα selbst der Erholung der Tumorzellen nach einer Chemotherapiebehandlung entgegenzuwirken. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um das komplexe Zusammenspiel zwischen CAFs und Luminal A Brustkrebszellen sowie speziell die Rolle von TNFα zu verstehen. Dabei sollte die Rolle von TNFα als zweischneidiges Schwert bei der Entscheidung über Behandlungsmöglichkeiten für refraktären Luminal A Brustkrebs berücksichtigt werden.