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Sequenzspezifischer DNA-Nachweis basierend auf Cu(II)-, Cu(I)- & Cu(0)-vermittelten Reaktionen : Entwicklung Ferrocen-basierter, zellspezifischer Cytostatika

Jentzsch, Elmar

English Title: Sequence specific DNA-detection based on reactions with Cu(II), Cu(I) and Cu(0) : Development of Ferrocene-based, cellspecific, cytotoxic drugs

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Abstract

Der erste Teil der vorliegenden Arbeit behandelt sequenzspezifische DNA Nachweismöglichkeiten, basierend auf Reaktionen, welche durch Kupfer in drei unterschiedlichen Oxidationsstufen (0, I und II) hervorgerufen werden. Die Esterspaltungsreaktion eines an PNA gekoppelten N-Methyl-2 -imidazolylcarbonsäure-Derivates wurde untersucht. Die Spaltung erfolgte durch ein zweites PNA-Konjugat, welches mit einem Cu(II)-Komplex modifiziert worden war. Beide PNA-Fragmente binden an direkt benachbarte Stellen doppelsträngiger DNA, wodurch die reaktiven Gruppen in unmittelbare Nähe zueinander gebracht werden und somit die Esterspaltungsreaktion beschleunigt wird. Nach der Hydrolyse trat N-Methyl-2-imidazolyl-carbonsäure aus, was mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie verfolgt werden konnte. Ein fluoreszenzspektroskopischer DNA-Nachweis gelang mit Hilfe der Cu(I)- katalysierten (2+3)-Huisgen-Cycloaddition, auch Click-Reaktion genannt. Hierzu wurden zwei kurze DNA-Stränge modifiziert. Der eine wurde am 5’-Ende mit einem nichtfluoreszenten, Acetylid-substituierten 1,8-Naphthalimidfarbstoff markiert. Der andere Strang wurde am 3’-Ende mit einem organischen Azid versehen. Beide DNAFragmente binden an direkt benachbarten Stellen an einzelsträngige DNA. Durch Zugabe von Cu(I) wurde das elektronenziehende Acetylid in ein elektronenschiebendes Triazol umgewandelt, was zu einer Zunahme der Fluoreszenz führte. Mit dieser Methode konnte DNA sequenzspezifisch bis zu einer Konzentration von 200 nM nachgewiesen werden. Bei Zugabe von 100 µM CuSO4 und 1 mM NaAsc konnte das Auftreten eines Peaks im Fluoreszenzspektrum bei 580 nm beobachtet werden. Diese zusätzliche Emission beruht auf der Bildung von Cu-Nanoteilchen, welche nur in Gegenwart doppelsträngiger DNA entstehen. Die Detektionsgrenze dieser Methode lag bei 1 nM dsDNA. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Synthese, Charakterisierung und Anwendung auf Ferrocen basierender, zellspezifischer Cytostatika beschrieben. In Krebszellen, welche eine deutlich höhere Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies besitzen als gesunde Zellen, wird die synthetisierte Substanz in zwei Cytostatika-Typen mit unterschiedlichen Wirkmechanismen umgewandelt: einerseits entsteht ein Chinonmethid-Derivat, welches den antioxidativen Schutzmechanismus der Zelle beeinflusst. Andererseits werden Fe(II)-Ionen freigesetzt, was die Generierung zusätzlicher reaktiver Sauerstoffspezies katalysiert. Dieser duale Wirkmechanismus erzeugt sehr schnell einen Zustand hohen oxidativen Stresses, was zum Tod der Krebszelle führt. Der IC50-Wert der Substanz liegt bei ~100 µM. Eine ebenfalls auf Ferrocen basierende Kontrollsubstanz zeigt bei dieser Konzentration keine Toxizität.

Translation of abstract (English)

The first part of this work deals with the sequence-specific detection of DNA. The described methods are based on reactions, which are triggered by Cu(II), Cu(I) or Cu(0), respectively. The ester-cleavage of an N-Methyl-2-imidazolyl-carbonicacid-derivative, which is attached to a PNA was examined. The cleavage was catalyzed by a second PNA conjugate, which was modified with a Cu(II)-complex. Both PNA-strands are binding to double stranded DNA in direct neighbourhood to each other, which brings the reactive groups into close proximity. As a consequence, the hydrolysis is accelerated and N-Methyl-2-imidazolyl-carbonic acid is cleaved off. This event can be followed by MALDI-TOF MS. The fluorogenic detection of DNA was achieved using Click-Chemistry, which is dependent on the use of Cu(I). For this purpose, two short DNA-strands where modified. The first one was labelled with a nonfluorescent Acetylide-substituted 1,8-Naphtylimide-dye, whereas the latter was substituted with an organic azide. Again both DNA-strands are designed in such a way that they bind to single stranded DNA in direct neighbourhood to each other. Upon addition of Cu(I) the electronwithdrawing Acetylide was transformed into an electrone-donating Triazole, which led to increasing of fluorescence. Using this method, DNA could have been detected sequence-specifically down to 200 nM. When 100 µM CuSO4 and 1 mM NaAsc were added, a peak in the fluorescence spectra was observed at 580 nm. This was due to the fact of appearance of Cu-Nanodots, which where built only in the presence of double stranded DNA. The detection limit of this method was 1 nM of dsDNA. The second part of the work describes the synthesis, characterization and the application of cell-specific cytostatic drugs, based on Ferrocene. Cancer cells contain a much higher amount of reactive oxygen species (ROS) then the normal ones. Within cancer cells, the described compound is cleaved into two different types of cytotoxic drugs. On the one hand a Quinone-methide derivative is produced, which depletes the antioxidant pool in the cell. On the other hand Fe(II)-cations are released, which induce the Fenton-reaction and thus produce even more ROS. The ROS generated in such a way will kill cancer cells. The IC50-value of the described compound is about 100 µM. The control-substance used, which also contains a ferrocene fragment, shows no toxicicity at this concentration.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krämer, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 6. November 2009
Date Deposited: 09. Nov 2009 11:24
Date: 2009
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: DNA-Detection , Cu-based reactions , Ferrocene , Cytotoxic drugs
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