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Aktivierung und Desensibilsierung des olfaktorischen cAMP-gesteuerten-Kanal : Identifizerung von funktionellen Modulen

Prinz zu Waldeck, Clemens

English Title: Activation and Desensitization of the Olfactory cAMP-gated Transduction Channel : Identification of Functional Modules

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PDF, German
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Abstract

Der olfaktorische zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kanal (CNG-Kanal) wandelt in den Riechneuronen das chemische Duftstoffsignal in ein elektrisches Signal um und spielt somit eine wichtige Rolle bei der Generierung, aber auch bei der Terminierung des Rezeptorstroms. Der CNG-Kanal ist ein heterotetrameres Protein und setzt sich aus den drei Untereinheiten CNGA2, CNGA4 und CNGB1b wie folgt zusammen: A2-A2-A4-B1b. Der CNG-Kanal ist ein unspezifischer Kationenkanl, der hauptsächlich Kalzium in die Riechneuronen leitet. cAMP öffnet den CNG-Kanal kooperativ, und die Sensivität des CNG-Kanals für cAMP wird durch Calmodulin Kalzium-abhängig moduliert. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der einzelnen Untereinheiten bei der Aktivierung und der Desensibilisierung des CNG Kanals in einem heterologen Expressionssystem (HEK 293-Zellen) untersucht. Bei den patch-clamp Untersuchungen wurde festgestellt, dass HEK 293 Zellen, die mit den drei Untereinheiten transfiziert wurden, nicht eine einheitliche Kanalpopulation exprimierten, sondern Mischungen von allen möglichen Kanalzusammensetztungen (A24, A23-A41, A23-B1b1, und A22-A41-B1b1). Allerdings wurden zwei Ausschlusskriterien zur Identifizierung von inside-out Patches, die fast ausschließlich A2-A2-A4-B1b Kanäle hatten, bestimmt. Erstens können die verschiedenen CNG Kanäle anhand ihrer Sensivität für cAMP unterschieden werden. Die Spannungsabhängigkeit der Aktivierungskonstante (K½) für cAMP ist das zweite Kriterium. Für den CNG-Kanal wurde vor kurzem das erste adäquate kinetische Modell (C4L-Modell) für die Aktivierung beschrieben. Das C4L-Modell beschreibt eine sequentielle Bindung von cAMP an den homomeren CNGA2-Kanal. In der vorliegenden Arbeit konnte das C4L-Modell für den heteromeren A2-A2-A4-B1b-Kanal erweitert werden. Mit Mutagense wurden die Bindestellen für cAMP auf den einzelnen Untereinheiten funktionell ausgeschaltet. Somit wurden A2-A2-A4-B1b Kanäle mit zwei bis vier intakten Bindestellen erzeugt. Die Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die Kanalaktivierung ergab die Reihenfolge, in der die vier Kanaluntereinheiten cAMP binden. Die beiden CNGA2-Untereinheiten vermitteln die ersten beiden cAMP-Bindungen und öffnen den Kanal. Die Bindung des dritten und vierten cAMPs kann von CNGA4 oder CNGB1b gleich gut vermittelt werden, und stabilisieren den Kanal im offenen Zustand. Für die schnelle Desensibilisierung des A2-A2-A4-B1b Kanals wurde überprüft, ob eine der beiden LQ-Typ Calmodulin-Bindestellen von CNGA4 und CNGB1b ausreicht, um den Kanal zu desensibilisieren. Dafür wurden die beiden LQ-Typ Calmodulin-Bindestellen durch Mutagense funktionell ausgeschaltet. Der Effekt der iii Mutationen auf den Kanal wurde mit der patch-clamp Technik untersucht. Dabei wurden Dosis-Wirkungs-Beziehungen für cAMP unter desensibilisierenden Bedingungen, dass heißt in der Gegenwart von Kalzium, erstellt. Die Analyse der Daten ergab, dass CNGB1b notwenig und ausreichend ist, den A2-A2-A4-B1b Kanal zu desensibilisieren.

Translation of abstract (English)

The cyclic nucleotide-gated channel in olfactory sensory neurons transforms a chemcial odorant stimulus into an electrical signal. The channel plays a key role for the generation as well as for the termination of the receptor current. The heterotetrameric channel is composed of CNGA2, CNGA4 und CNGB1b subunits with the following stoichiometry: A2-A2-A4-B1b. The channel is an unspecific cation channel, which mainly conducts calcium ions into the neuron. cAMP activates and opens the channel cooperatively, and its sensivity to cAMP is modulated by calmodulin in a calcium-dependent way. In the present thesis, the contribution of individual subunits for channel activation and desensitization was investigated in a heterologous expression system (HEK 293 cells). Patch clamp measurements of HEK 293 cells cotransfected with CNGA2, CNGA4 and CNGB1b showed, that HEK 293 cells do not express one specific channel population, but instead a mixture of all possible subunit combinations (A24, A23-A41, A23-B1b1, und A22-A41-B1b1). However, it was possible to determine two criteria to identify inside-out patches with predominant A2-A2-A4-B1b expression. Each CNG-channel has a distinct cAMP-sensitivity and shows a specific current rectification. The first adequate kinetic model (C4L-model) for CNG-channel activation has been described recently. This model depicts a sequential binding of four cAMP molecules to homomeric A2-channels. In the present thesis the C4L-model was extended for the heteromeric A2-A2-A4-B1b channel. Using site-directed mutagenesis of the cAMP-binding-site, each subunit was selectively rendered inoperable. Thus A2-A2-A4-B1b channels with either two, three or four intact cAMP-binding-sites were generated. The analysis of the dose-dependent channel activation revealed the cAMP-binding-sequence of the four channel-subunits. The two CNGA2-subunits initially bind two cAMP-molecules and open the channel. Binding of the third and fourth cAMP-molecule was equally well mediated by CNGA4 und CNGB1b, and stabilized the channel in the open state. Furthermore, for rapid desensitization of A2-A2-A4-B1b channels, it was examined whether one of the two LQ-type calmodulin-binding-sites is sufficient to desensitize the channel. Thus, the two LQ-type calmodulin-binding-sites were functionally silenced by mutagenesis. The effect of the mutations on the channel were analysed with the patch-clamp-technique. Dose-response relations were generated in the presence of calcium to simulate the condition of desensitization. The analysis revealed, that CNGB1b ist sufficient and necessary to desensitize the A2-A2-A4-B1b channel

Item Type: Dissertation
Supervisor: Frings, Prof. Dr. Stephan
Date of thesis defense: 6 August 2009
Date Deposited: 20 Nov 2009 13:28
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Signaltransduktion , Ionenkanal , ORN , cAMP , SchaltverhaltenSignaltransduction , Ionchannel , ORN , cAMP , Gating
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