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Fabrication and Characterization of Extracellular Matrix Nanofibrils

Kaiser, Peter

German Title: Herstellung und Charakterisierung von Extrazellulären Matrix Nanofibrillen

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Abstract

All cells in our body are surrounded by Extra Cellular Matrix (ECM), from which they derive biochemical, structural and mechanical signals. One of the main fibrillar ECM protein components is Fibronectin (Fn), which is believed to act as a mechanochemical signal transducer. A current hypothesis is that Fn can undergo structural transitions upon stretching, which can alter Fn binding site accessibility and ultimately lead to an adapted cell response. While this hypothesis has existed for several years, the lack of suitable model systems prevented its proof. The aim of this work was to (i) produce regular arrays of Fn nanofibrils, (ii) control the alignment, diameter and tensile state of those nanofibrils, and (iii) to determine their structural and mechanical properties. During this work, a new method to create regular arrays of Fn nanofibrils was developed. This method allows the control of nanofibril directionality and diameter and can also be used to produce nanofibrils from other ECM proteins, such as Laminin (LM) and Collagen (COL). The method depends both on a protein’s ability to accumulate at the air-buffer interface and its ability to self-associate. The production of nanofibrils from various polymers that share these properties is thus possible. The resulting nanofibrillar arrays can be produced on a variety of mirostructured materials, ranging from Silicon over Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) to Polyurethane (PU). The biofunctionality of different ECM nanofibrillar arrays was demonstrated by specific cell adhesion after nanofibril transfer onto non-fouling Polyethyleneglycol (PEG) hydrogels. An investigation of both the molecular structure and the mechanical properties of Fn nanofibrils was performed by Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and Atomic Force Microscopy (AFM) experiments. Fn molecules form a surface film after application of Fn into a drop of Phosphate Buffered Saline (PBS). FRET analysis of Fn was performed to determine the degree of Fn molecular unfolding. It could be shown that Fn within surface films only unfolds upon surface dewetting, which coincides with nanofibril formation. The produced nanofibrils show an elongation at break of 200 %. Ruptured nanofibrils retract to 30 % of their original length, but the Fn molecules within nanofibrils do not re-fold completely, as derived from FRET measurements. The pre-strained Fn nanofibrils display a high effective Young’s modulus of E ~ 0.1 - 6 GPa, as determined by AFM experiments. In summary, the production, control and characterization of novel ECM models was accomplished in this work, which can be used to investigate cell adhesive response.

Translation of abstract (German)

Alle tierischen Zellen sind von Extrazellulärer Matrix (EZM) umgeben, die chemische, strukturelle und mechanische Information birgt. Einer der häufigsten Proteinbestandteile der EZM ist Fibronektin (Fn), ein potenzieller mechanochemischer Signalüberträger. Es wird vermutet, dass faserbildende Fn Moleküle bei Dehnung der Matrix Konformationsänderungen eingehen. Dadurch würde das Bindungsrepertoire und damit auch die Zellantwort der mechanischen Beanspruchung angepasst. Ein Mangel an geeigneten Modellsystemen hat bisher die Prüfung dieser Hypothese verhindert. Ziel dieser Arbeit war daher, (i) regelmäßige Anordnungen von Fn Nanofibrillen herzustellen, (ii) deren Ausrichtung und Spannungszustand zu steuern und (iii) ihre strukturellen und mechanischen Eigenschaften zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neueMethode zur Herstellung von Fn Nanofibrillen entwickelt. Diese Methode basiert auf der Entnetzung einer superhydrophoben Oberfläche und ermöglicht die Kontrolle von Ausrichtung und Durchmesser der Nanofibrillen. Die Methode beruht sowohl auf der Eigenschaft eines Proteins, sich an der Luft-Puffer Grenzfläche anzureichern, als auch auf seiner Fähigkeit zur Selbstbindung. Es konnte gezeigt werden, dass auch Nanofibrillen anderer EZM Proteine, wie Laminin (LM) oder Collagen (COL) hergestellt werden können. Mikrostrukturen aus Silizium, Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) und Polyurethan (PU) zeigten hierbei identische Fähigkeiten der Fibrillenbildung. Eine zellbiologische Anwendung wurde erarbeitet, um die Anwendbarkeit der künstlich hergestellten Fasern zu testen. Auf nicht adhäsiven Poly(ethylenglycol) (PEG) Hydrogele binden Zellen spezifisch nach kovalentem Transfer der Nanofibrillen. Sowohl der molekulare Faltungszustand als auch die mechanischen Eigenschaften von Fn Nanofibrillen wurden untersucht. Nach Zugabe von Fn in Pufferlösung reichern sich Fn Moleküle in einem Oberflächenfilm an. Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Untersuchungen zeigten, dass Fn Moleküle in diesem Oberflächenfilm erst bei Entnetzung der Mikrostrukturen entfaltet werden. Dies geschieht gleichzeitig mit der Bildung von Fn Nanofibrillen. Die so entstandenen Nanofibrillen versagen mechanisch bei einer Dehnung von 200 %. Geborstene Nanofibrillen kontrahieren bis auf 30 % ihrer Originallänge. Dies geht jedoch nicht mit einer kompletten Rückfaltng der Fn Moleküle einher. Durch Raster Kraft Mikroskopie (RKM) von Fn Nanofibrillen wurde ein effektiver Young’s Modulus von E ~ 0.1 - 6 GPa ermittelt. Zusammengefasst wurde die Herstellung, Kontrolle und Charakterisierung neuer EZM Modellsubstrate erreicht und damit neue Möglichkeiten zur Untersuchung der Zellantwort auf EZM Bestandteile geschaffen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim Pius
Date of thesis defense: 3 December 2009
Date Deposited: 07 Jan 2010 10:42
Date: 2009
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Fibronectin, Kollagen, Laminin, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, Kraftmikroskopie
Uncontrolled Keywords: Nanofibrils , Extracellular Matrix
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