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Funktionelle Charakterisierung des Retromer-vermittelten Proteintransports in Pflanzen

Niemes, Silke

English Title: Functional characterisation of the retromer-mediated protein transport in plants

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Abstract

Das pflanzliche Retromer besteht aus einem großen Subkomplex aus den vakuolären Proteinsortierungsproteinen VPS26, VPS29 und VPS35 und einem kleinen Subkomplex, der sich vermutlich aus den Sorting Nexinen (SNX) SNX1, SNX2a und SNX2b zusammensetzt. Rezeptor-vermittelte Sortierungsprozesse im sekretorischen Transportweg eukaryontischer Zellen beruhen auf dem Mechanismus des Rezeptor-Rezyklierens, nachdem der Transport beendet wurde. In Pflanzen ist der vakuoläre Sortierungsrezeptor (VSR) BP80 an dem Transport von Molekülen zur lytischen Vakuole beteiligt. BP80 bindet vermutlich seine Liganden in dem Donor-Kompartiment trans-Golgi Netzwerk. Dieser Rezeptor-Liganden-Komplex wird danach mit Hilfe von Clathrin-Vesikeln zum prävakuolären Kompartiment (PVC) transportiert. Während die Liganden freigesetzt und zur lytischen Vakuole transportiert werden, wird der Rezeptor Retromer-vermittelt zurück zum TGN transportiert, um erneut Liganden transportieren zu können. Zur Analyse des Retromer-vermittelten Rezyklierens der VSRs wurden die Retromer-Komponenten SNX1, SNX2a, VPS29 und VPS35 zunächst lokalisiert. Diese Retromer-Komponenten befanden sich ausschließlich am trans-Golgi Netzwerk (TGN). Die Inhibierung der Retromer-Funktion durch die transiente Expression von SNX1- oder SNX2a-Mutanten führte zu einer Akkumulation des VSR BP80 im TGN. Quantitative Proteintransportuntersuchungen sowie konfokal-mikroskopische Analysen mit fluoreszierenden, vakuolären Markerproteinen zeigten, dass die Liganden unter diesen Bedingungen weiterhin die Vakuole erreichen konnten. Anhand dieser Ergebnisse erscheint das TGN als der Ort des Retromer-vermittelten Rezyklierens des VSRs. Außerdem ist der Transport zur lytischen Vakuole ab dem TGN Rezeptor-unabhängig und geschieht möglicherweise durch Reifung. Die komplette Hemmung der Retromer-Funktion entweder durch RNAi-„knock-down“ der SNXs oder durch Koexpression der SNX1- und SNX2a-Mutanten inhibierte spezifisch den ER-Export der VSRs und löslicher, vakuolärer Frachtmoleküle. Der COPII-vermittelte Transportweg wurde dabei nicht beeinflusst. Durch die Expression ER-verankerter BP80-Konstrukte konnte untersucht werden, ob die VSRs dazu in der Lage sind, ihre Liganden bereits im Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) zu binden. Diese Experimente führten zu einer Akkumulierung löslicher, vakuolärer Frachtmoleküle im ER. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Rezeptor-Liganden-Interaktion bereits im ER stattfindet und nicht erst im TGN. Darüber hinaus rezykliert Retromer die VSRs vermutlich vom TGN zurück zum ER.

Translation of abstract (English)

Plant retromer consists of the large sub complex with the vacuolar protein sorting proteins VPS26, VPS29 and VPS35 and a small sub complex probably formed by Sorting Nexins (SNX) 1, SNX2a and SNX2b. Receptor-mediated sorting processes in the secretory pathway of eukaryotic cells rely on mechanisms to recycle the receptors after completion of transport. In plants, the vacuolar sorting receptor (VSR) BP80 is involved in trafficking of molecules to the lytic vacuole. BP80 is supposed to bind its ligands in the donor compartment (trans-Golgi network). The receptor-ligand complex is then transported to the prevacuolar compartment (PVC) in a clathrin-dependent manner. Whilst the ligands are released and transported to the lytic vacuole, the receptor is recycled back to the TGN in a retromer-dependent fashion for a further round of ligand transport. To analyse retromer-mediated VSR recycling, first the retromer components SNX1, SNX2a, VPS29 and VPS35 were firstly localised. All retromer components were localised to the trans-Golgi network (TGN). Inhibition of retromer function by transient expression of SNX1 or SNX2a mutants leads to an accumulation of the VSR BP80 at the TGN. Quantitative protein transport studies as well as live cell imaging using fluorescent vacuolar cargo molecules revealed that the arrival of these VSR ligands at the vacuole is not affected under these conditions. Based on these findings, the TGN seems to be the point of retromer-mediated recycling of VSRs. Therefore, transport towards the lytic vacuole downstream of the TGN is receptor-independent and occurs via maturation. Complete inhibition of retromer function either by RNAi knock-down of SNXs or coexpression of mutants of SNX1/2a specifically inhibits the ER export of VSRs, as well as soluble vacuolar cargo molecules, but does not influence cargo molecules of the COPII-mediated transport route. The expression of ER-anchored VSR derivatives revealed, whether VSRs are capable of binding their ligands already in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), since these experiments resulted in an ER accumulation of soluble vacuolar cargo molecules. This demonstrates that the ER, rather than the TGN, is the location of the initial VSR-ligand interaction. Furthermore, retromer presumably recycles VSRs from the TGN back to the ER.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Robinson, Prof. Dr. David G.
Date of thesis defense: 21. December 2009
Date Deposited: 08. Jan 2010 10:25
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 580 Botanical sciences
Controlled Keywords: Proteintransport, Endoplasmatisches Retikulum, Rezeptor
Uncontrolled Keywords: Sorting Nexine , Retromer , BP80 , vakuolärer SortierungsrezeptorSorting Nexins , retromer , BP80 , vacuolar sorting receptor
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