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Rezeptormethylierung und Stabilität von Chemotaxisclustern in Escherichia coli

Schulmeister, Sonja Elke

English Title: Receptormethylation and stability of chemotaxis clusters in Escherichia coli

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PDF, German
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Abstract

Die Chemotaxis erlaubt es Bakterien, schnell optimale Wachstumsbedingungen zu finden. Die Wahrnehmung taktischer Reize erfolgt mithilfe eines hoch konservierten Signaltransduktionswegs, der zu den für Prokaryoten typischen Zwei-Komponenten-Systemen zählt. Am besten untersucht ist das Chemotaxissystem von Escherichia coli, welches den Zellen ermöglicht, sich gezielt auf Lockstoffe zu und von Schreckstoffen weg zu bewegen. Effektoren werden von Transmembranrezeptoren erkannt, die in polaren und lateralen Clustern organisiert sind. Der Clusterkern besteht aus Rezeptoren, der Histidinkinase CheA und dem Adapterprotein CheW. Alle anderen Chemotaxisproteine wie der primäre Responseregulator CheY und seine Phosphatase CheZ sowie die Adaptationsproteine CheR und CheB lokalisieren entweder an Rezeptoren oder an CheA. Trotz minimaler Komplexität ist dieses System zu einer erstaunlichen Leistung fähig, die trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten nicht detailliert erklärt werden kann. Dabei fehlt es unter anderem an Daten, die die Dynamik der beteiligten Komponenten beschreiben. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war daher die systematische Analyse der intrazellulären Mobilität aller Chemotaxisproteine am Rezeptorcluster in vivo durch FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Rezeptoren sehr stabil in die Cluster eingebunden sind und zusammen mit CheA und CheW ein Grundgerüst bilden, an das die anderen Chemotaxisproteine mit geringerer Affinität binden, wobei sich die Stärke der Assoziation nach der jeweiligen Proteinfunktion richtet. Außerdem konnte beobachtet werden, dass aktive Cluster stabiler sind. Die Temperatur dagegen scheint keinen Einfluss auf die Clusterstabilität zu haben und auch eine Wanderung bivalenter Proteine innerhalb des Chemotaxisclusters wurde nicht beobachtet. Eine Voraussetzung für das Funktionieren der Chemotaxis ist die Adaptation, welche es der Zelle ermöglicht, auf Änderungen der Effektorkonzentration zu reagieren. Die Adaptation erfolgt in E. coli auf Rezeptorebene mithilfe der beiden Proteine CheR und CheB, die die Aktivität der Rezeptoren durch kovaltente Modifikation regulieren. Während die Methyltransferase CheR konstitutiv aktiv ist, ist die Aktivität der Methylesterase CheB über einen negativen Feedback-Mechanismus an die Histidinkinase gekoppelt. Die langjährige Annahme, dies reiche für die Adaptation aus, konnte in dieser Arbeit widerlegt werden, und die eigentliche Funktion der CheB-Phosphorylierung wurde untersucht. Die hier durchgeführten Experimente zeigen zum einen, dass die Bindung von CheB an das Chemotaxiscluster durch Aktivierung stabilisiert wird. Zum anderen zeigen sie, dass die Phosphorylierung von CheB eine Robustheit gegenüber zellulären Schwankungen der Chemotaxisproteine vermittelt. Die Untersuchung von Methylierungsreaktionen an Rezeptoren ergab, dass sich durch Clusterbildung die Geschwindigkeit der Modifikation um 40% beschleunigt. In heterogenen Rezeptorclustern, bestehend aus beiden Hauptrezeptoren, konnte eine Kreuzmethylierung des Aspartat-Rezeptors Tar infolge der Stimulation mit Serin, aber keine Methylierung des Serin-Rezeptors Tsr bei Stimulation mit α-Methylaspartat, festgestellt werden. Dies deutet auf eine schwache Rezeptorkopplung innerhalb eines Clusters hin, bei der vorwiegend ligandengebundene, aktive Rezeptoren durch CheR methyliert werden. Somit konnte in dieser Arbeit die Theorie eines alternativen Adaptationsmodells untermauert werden, in dem Methylierungs- und Demethylierungsreaktionen auf der Aktivität der Rezeptoren beruhen. Zusätzlich könnten die oben erwähnten aktivitätsabhängigen Proteinaustausche bei der Adaptation eine Rolle spielen. In dieser Studie wurde offenbar, dass dynamische Wechselwirkungen an Rezeptorclustern eine bisher kaum beachtete Ebene der Regulation in der Chemotaxis von E. coli darstellen.

Translation of abstract (English)

Chemotaxis enables bacteria to quickly find optimum growth conditions. Sensing attractants or repellents is based on a simple two-component signaltransduction system. The chemotaxis system of Escherichia coli is thoroughly studied and allows cells to move towards attractants and away from repellents. Effectors are sensed by transmembrane receptors, which are organized in polar and lateral clusters. The cluster core is composed of receptors, the histidine kinase CheA and the adaptor protein CheW. All other chemotaxis proteins, like response regulator CheY and its phosphatase CheZ, as well as the adaptation proteins CheR and CheB, localize either to receptors or to CheA. Despite minimal complexity, this system demonstrates amazing performance that remains partly unaccounted for, despite decades of intensive research. Amongst others, there is a lack of data describing the temporal dynamics of involved components. Therefore a focus of this work was to systematically analyze the intracellular mobility of all chemotaxis proteins on receptor clusters in vivo, using FRAP (fluorescence recovery after photobleaching). Here we show that receptors are very firmly integrated in clusters and together with CheA and CheW build a core structure, with which the remaining components associate with lower affinity, with the strength of the interaction being dependent on the respective protein function. We also observed that active clusters are more stable. In contrast, temperature seems to have no effect on cluster stability and we did not observe brachiation of bivalent proteins within chemotaxis clusters. Effective chemotaxis requires adaptation, which enables bacteria to response to changes in concentrations of effectors. The Adaptation system of E. coli comprises two adaptation proteins, CheR and CheB, which regulate receptor activity by modification. While methyltransferase CheR is constitutively active, methylesterase CheB is activated via phosphotransfer from CheA. It was reckoned for many years that this negative feedback mechanism is sufficient for adaptation. However, in this work we could demonstrate that this is not the case. We thus accessed the real function of CheB phosphorylation. Our experiments demonstrate that activation of CheB stabilizes its binding to chemotaxis clusters and mediates robustness against cellular variations of chemotaxis proteins We investigated methylation reactions on receptors and found that clustering accelerates modification about 40%. In heterologous receptor clusters, consisting of both major receptors, we observed crossmethylation of aspartate receptor Tar as a result of stimulation by serine. On the other hand, α-methylaspartate did not cause crossmethylation of serine receptor Tsr. This indicates a weak receptor coupling within receptor clusters, which result in selective methylation of ligand-bound receptors by CheR. These results support a theory in which methylation and demethylation reactions rely on receptor activity. Additionally, the activity-dependent changes in cluster stability mentioned above could play a role in adaptation. This study reveals that dynamic interactions at receptor clusters represent a so far little-noticed level of regulation in chemotaxis of E. coli.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sourjik, Prof. Dr. Victor
Date of thesis defense: 2. March 2010
Date Deposited: 19. Mar 2010 07:36
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Escherichia coli, Chemotaxis
Uncontrolled Keywords: Fluorescence Recovery After Photobleaching , Adaptation , RezeptorkopplungEscherichia coli , chemotaxis , fluorescence recovery after photobleaching, adaptation , receptor-coupling
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