Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Interaktionen verschiedener Formulierungen von Poly(n-butylcyanoacrylat)-Nanopartikeln mit der Blut-Hirn-Schranke in vivo und in vitro

Reimold, Isolde Maria

English Title: Interactions of different poly(n-butylcyanoacrylate)-nanoparticle formulations with the blood-brain barrier in vivo and in vitro

[img]
Preview
PDF, German Print-on-Demand-Kopie (epubli)
Download (15Mb) | Lizenz: Print on Demand

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Krankheiten des Zentralnervensystems (ZNS) können meist nicht zufriedenstellend behandelt werden, da die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als Schutzwall das ZNS vor dem Eindringen körperfremder und dadurch vieler Arzneistoffe abschirmt. Nach der Literatur sind beladene, mit Polysorbat 80 (P-80) umhüllte PBCA-NP in der Lage, zentrale pharmakologische Effekte hervorzurufen. Diese Arbeit sollte daher die Interaktion beladener PBCA-NP mit der BHS in mehrerlei Hinsicht näher beleuchten. Zuerst sollte die Passage von mit verschiedenen Modell-Substanzen (FITC-Dextran, Rhodamin 123 und Doxorubicin) beladenen NP durch die BHS in vivo dargestellt werden. Dabei war zu untersuchen, ob eine Oberflächenmodifikation mit P-80 essentiell für eine Passage der BHS ist. Anhand von konfokal-mikroskopischen Aufnahmen konnte für alle drei NP-Formulierungen demonstriert werden, dass die PBCA-NP die BHS passierten. Ebenso wurde bewiesen, dass eine Umhüllung der NP mit P-80 unbedingt notwendig für eine Permeation der BHS ist. Da Doxorubicin cardiotoxisch ist, sollte für die Doxorubicin-NP darüber hinaus untersucht werden, inwieweit sich die Anreicherung des freien Doxorubicins von der des partikulär gebundenen unterscheidet. Die qualitative Analyse legt nahe, dass die partikuläre Form aufgrund einer geringeren lokalen Konzentration des freien Doxorubicins weniger kardiotoxisch ist als die freie Substanz, da Proben mit freiem Doxorubicin eine flächige Fluoreszenz zeigten, während die partikulären Zubereitungen punktuell fluoreszierten. Im Anschluss wurde die Freisetzung von Doxorubicin aus PBCA-NP in vitro in Puffer und Gehirnhomogenat quantitativ bestimmt. Dazu wurde zunächst sowohl eine präparative als auch eine analytische Aufreinigungsmethode für die NP mit Größenausschlusschromatographie etabliert. Die Freisetzung in Puffer war im Gegensatz zum Gehirnhomogenat leicht pH-abhängig, denn bei pH 7,4 war sie größer als bei pH 5. Sie folgte stets einer Kinetik 0. Ordnung. Im nächsten Teil der Arbeit sollte der Aufnahmemechanismus von NP ins Gehirn am Beispiel Rhodamin 123 beladener NP untersucht werden. Dazu wurde die Interaktion von PBCA-NP mit isolierten Schweinehirn-Kapillarendothelzellen betrachtet. Zunächst wurde der Einfluss von P-80 Coating in serumfreiem Medium getestet. Ohne P-80 Modifikation adsorbierten die NP an die Zellen, während mit P-80 die NP eindeutig in die Zellen aufgenommen wurden. Die Literatur enthält Hinweise, dass mit P-80 beschichtete NP durch Adsorption von Apolipoproteinen im Blutstrom per rezeptorvermittelter Endozytose bzw. Transzytose ins Gehirn gelangen können. Weshalb aber eine Aufnahme der gecoateten NP in Abwesenheit von Apoliproproteinen in die Zellen erfolgte, war nun durch Aufnahme-Experimente mit Serumzusatz zu untersuchen. Der Serumzusatz resultierte jedoch in einer massiven Aufnahmehemmung. Möglicherweise führte ein Überangebot an Apolipoproteinen zu einer kompetitiven Hemmung oder aber der Aufnahmemechanismus ist ein gänzlich anderer. Abschließend wurde mit diesen Primärzellen der AlamarBlue™ Assay durchgeführt, um die Auswirkungen verschiedener PBCA-NP Konzentrationen auf den Zellstoffwechsel zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die Inkubation mit PBCA-NP zunächst (bis 120 µg/ml) den Stoffwechsel der PBCEC anregte, dieser dann stagnierte (240-480 µg/ml) und dass bei hohen Konzentrationen (>960 µg/ml) die Zellen starben. Folglich könnte der Aufnahmemechanismus der NP ATP-abhängig sein, denkbar wäre auch eine Entzündungsreaktion. Letzteres erscheint plausibler, da in der Literatur gezeigt werden konnte, dass der transendotheliale Widerstand primärer Gehirnzell-Monolayer nach Konfrontation mit PBCA-NP zeitweise massiv sank. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die in dieser Dissertation untersuchten PBCA-NP eine Arzneiform darstellen, die zur Behandlung von Erkrankungen des ZNS verwendet werden können, da sie in der Lage sind, die BHS zu passieren, den inkorporierten Wirkstoff nach 0. Ordnung kontrolliert freisetzen und erst in recht hohen Konzentrationen zum Zelltod führen.

Translation of abstract (English)

Many diseases of the central nervous system (CNS) cannot be treated successfully because the blood-brain barrier (BBB) acts as a firewall against both xenobiotics and pharmacologically active substances. The literature includes many reports about how loaded and surface modified poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles may lead to central mediated effects. Within this body of work, the interaction between loaded PBCA nanoparticles and the BBB in vivo and in vitro should be elucidated in several aspects. First the passage of nanoparticles loaded with different model compounds (FITC-dextran, rhodamine 123 and doxorubicin) through the BBB in vivo was studied. These experiments concentrated on the question of whether surface modification of the nanoparticles with polysorbate 80 is really essential to overcome the BBB. Careful analysis by confocal laser scanning microscopy gave clear evidence that PBCA-nanoparticles passed the BBB. Furthermore it was shown that nanoparticle-coating with p-80 is necessary to overcome the BBB. Due to the cardio-toxic side effects of doxorubicin, the extent of tissue distribution in the heart was investigated for this formulation of nanoparticles. The effect of free and particle bound doxorubicin was studied. Qualitative analysis of confocal pictures indicated less cardiotoxicity as a result of lower local doxorubicin concentrations for the particle-bound substance than for free doxorubicin. Free doxorubicin showed a more uniform distribution in the tissue, whereas the particle-bound substance exhibited a more punctuated pattern. Following the in vitro release of doxorubicin loaded PBCA nanoparticles was quantified in buffer and brain homogenate. For this purpose a size exclusion chromatography method for prepara-tive and analytical use was established to purify the nanoparticles from remaining free and particle-adsorbed doxorubicin. Compared to the release-properties in brain homogenate, the release in buffer showed a certain pH dependency, because with pH 7,4 the release was slightly more than with pH 5. This release occurred always according to a zero order kinetics. The next section explores the uptake mechanism of rhodamine 123 loaded PBCA nanoparticles by the brain. Therefore, the interaction of these nanoparticles with monolayers of porcine brain capillary endothelial cells (PBCEC) was monitored. First the influence of p-80 coating of PBCA nanoparticles in serum-free medium was tested. Without p-80 modification a strong adsorption of nanoparticles at the cell surfaces was observed whereas with p-80 coating an uptake in the cells could be assessed. In the literature there are some references which indicate that p-80 coated nanoparticles adsorb lipoproteins from the bloodstream on their surface, bind to a lipoprotein-receptor at the BBB and may undergo receptor-mediated endo- or transcytosis and thus pass the BBB. Since the previous experiments were performed in a serum free medium, then the question arises of why the nanoparticles were internalised into the PBCEC even though there were no lipoproteins present. To discover the influence of lipoproteins, serum was added during the experiments. This addition of serum lead to a strong inhibition of nanoparticle uptake to PBCEC. Possibly this occurred due to a competitive inhibition through lipoproteins present in serum or the uptake-mechanism could be completely different. Finally the AlamarBlue™ Assay was performed to investigate the influence of different PBCA nanoparticle concentrations of unloaded nanoparticles on PBCEC metabolism. Results showed an increase of cell metabolism up to a certain nanoparticle concentration (15-120 µg/ml) followed by a stagnancy during higher concentrations (240-480 µg/ml) to the point of a breakdown and cell-death at high concentrations (960-2000 µg/ml). The reason for an increase of cell meta-bolism could be an ATP-dependent uptake-mechanism or perhaps an inflammatory response to nanoparticle exposition. This possibility seems more likely, because the literature confirms that the transendothelial electrical resistance (TEER) of PBCEC temporarily decreased a lot. In conclusion, this work demonstrates that PBCA nanoparticles can be used for the treatment of CNS diseases due to their ability to pass the BBB. Furthermore the incorporated drug is relea-sed by a zero order kinetics and toxic effects occur only at high nanoparticle-concentrations.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Fricker, Prof. Dr. Gert
Date of thesis defense: 18. March 2010
Date Deposited: 27. May 2010 14:07
Date: 2010
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Nanopartikel, Blut-Hirn-Schranke
Uncontrolled Keywords: Alkylcyanoacrylate , Butylcyanoacrylat , bioabbaubar , PBCECnanoparticles , blood-brain barrier
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative