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A Novel Method for Quantitative and Structural Determination of Molecular Complexes by Photon Antibunching

Ta, Haisen

German Title: Eine neuartige Methode zur quantitativen und strukturellen Bestimmung molekularer Komplexe von Photon Antibunching

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Abstract

In optical microscopy fluorescent molecules are used to label target structures like proteins or DNA.With confocal microscopy, a complex of multiple fluorescent molecules is detected as a point spread function due to the diffraction limit. A particular challenge is to determine the number of molecules hiding behind the point spread function. In this work an extended method for determining the number of fluorescent molecules is presented. The method is based on photon antibunching, which is the phenomenon that a single fluorescent molecule can emit only one photon at a time. A statistical analysis of coincidently detected photons can be used to determine the number of photon emitters. In previous works the maximal number of molecules that can be distinguished was about 3. This has now been extended by doubling the number of detectors from 2 to 4, so that up to 4 simultaneously emitted photons can be detected. A new data analysis procedure was established according to the changes of the scheme. Simulations have shown that in theory up to 50 molecules can be resolved under realistic conditions. These predictions were experimentally validated with immobilized dsDNA labeled with 5 fluorophores. The consideration of photobleaching in the data analysis and the use of a photo-stabilizer enable up to 15 molecules to be determined. Thus, this method provides a promising tool for determining the stoichiometry of various biomolecular complex, which can not be achieved by normal microscopic methods.

Translation of abstract (German)

In der optischen Mikroskopie werden fluoreszierende Moleküle verwendet, um Zielstrukturen wie Proteine oder DNA zu markieren. Mit Hilfe der konfokalen Einzelmolekülmikroskopie können diese innerhalb der beugungsbegrenzten Auflösung als Punktabbildung detektiert werden. Eine besondere Herausforderung dabei ist es, die Anzahl der Moleküle, die sich hinter einer solchen Punktabbildung verbergen zu bestimmen. In dieser Arbeit wird eine, auf Photon- Antibunching basierende, Methode zur Bestimmung der Anzahl fluoreszierender Moleküle in einer solchen Abbildung erweitert. Photonen Antibunching basiert auf dem Phänomen, dass ein einzelnes fluoreszierendes Molekül nach Anregung nur maximal ein Photon emittieren kann. Anhand einer statistischen Analyse über gleichzeitig detektierte Photonen kann dann eine Abschätzung über die Anzahl der Emitter gegeben werden. In früheren Arbeiten konnte damit bis zu 3 Moleküle gezählt werden, eine höhere Anzahl konnte nicht mehr sicher bestimmt werden. In dieser Arbeit wurde dieser Ansatz erweitert. Die Anzahl Detektoren wurde verdoppelt, so dass bis zu 4 gleichzeitig emittierte Photonen detektiert werden konnten. Entsprechend wurde die statistische Auswertung angepasst. Mit Hilfe simulierter Daten konnte gezeigt werden, dass nun theoretisch bis zu 50 Moleküle gezählt werden können. Erste Experimente an immobilisiertem Konstrukt aus 5-fach Fluoreszenzmarkierten DNS Proben bestätigten die Methode. Unter Berücksichtigung der Photozerstörung in der Datenanalyse, sowie die Verwendung von Photostabilisatoren konnte die Methode bis zu 15 Moleküle sicher bestimmen. Damit stellt sie ein vielversprechendes Werkzeug zur Bestimmung der Stöchiometrie diverser Biomolekülkomplexe dar, die durch normale mikroskopische Verfahren nicht möglich ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Herten, Dr. PD Dirk-Peter
Date of thesis defense: 5 February 2010
Date Deposited: 08 Apr 2010 07:19
Date: 2010
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: photon-antibunching stiochiometry
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