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The Role of CD95 Glycosylation in CD95 Signaling

Shatnyeva, Olga M.

German Title: Die Rolle von CD95 Glycosylation in CD95 Signaling

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Abstract

The CD95 (APO-1/Fas)-mediated apoptotic pathway is one of the well-studied death receptor pathways. CD95 is a highly glycosylated type I transmembrane protein and has a molecular mass of 37.5 kDa. The N-terminal domain of CD95 contains two putative N-linked glycosylation sites at N118 and N136 and posttranslational glycosylation leads to an increase of molecular mass of CD95 to 45–52 kDa. Upon stimulation of CD95, either with its natural ligand CD95L or with agonistic antibodies such as anti-APO-1, a Death-Inducing Signaling Complex (DISC) is formed. The DISC consists of oligomerized, most probably trimerized, CD95, the DD-containing adaptor molecule Fas associated death domain containing protein (FADD), procaspase-8, procaspase-10 and cellular FLICE inhibitory protein (c-FLIP). The interactions between the molecules in the DISC are based on homophilic contacts. The death domain (DD) of CD95 interacts with the DD of FADD while the death effector domain (DED) of FADD interacts with the N-terminal tandem DED of procaspase-8. Binding of procaspase-8 to the DISC results in its autocatalytic cleavage with the formation of the mature caspase-8 which is released into the cytosol to propagate the apoptotic signal. The data presented here show that N-glycosylation of CD95 influences death-inducing signaling complex (DISC) formation and procaspase-8 activation at the CD95 DISC. Treatment with the chemical inhibitors of N-glycosylation tunicamycin and Deoxymannojirimycin (DMM), neuraminidase from Vibrio cholerae and generation of CD95 glycosylation mutants at N136 and N118 show that N deglycosylation of CD95 results in the reduction of caspase-8 processing at the DISC. Modelling of the core CD95 DISC structure and the structure of the CD95 DISC network on the membrane indicated that the glycan attached to N118 could be important for the contacts between neighboring DISCs forming a network. A glycan moiety attached to N136 of CD95 could be important for the complex formation and/or stability as it is located in close proximity to one of the CD95L molecules. The present study shows that the CD95 glycostructure can contribute to the amount of generated caspase-8, which defines cell death initiation. This regulation might be important for cancer cells when a subtle difference in the amount of activated caspase-8 regulates life or death of the cell.

Translation of abstract (German)

Apoptose ausgelöst durch CD95 (APO-1/Fas) gehört zu den bestuntersuchtesten Signalwegen. CD95 ist ein hochglykosyliertes Typ I Transmembranprotein und hat eine molekulare Masse von ca. 37,5 kDa. Die N-terminale Domäne von CD95 enthält zwei mögliche stickstoffverbundene Glykosylierungsstellen an Position N118 und N136. Die posttranslationale Glykosylierung führt zu einer Erhöhung der molekularen Masse von CD95 auf 45–52 kDa. Nach Stimulierung von CD95 mit seinem natürlichen Liganden CD95L oder mit dem agonistischen Antikörper anti-APO-1, bildet sich der Death-Inducing Signaling Complex (DISC). Der DISC besteht aus oligomerisiertem, wahrscheinlich trimerisiertem CD95 und dem Adaptermolekül Fas associated death domain containing protein (FADD), Procaspase-8, Procaspase-10 und cellular FLICE inhibitory protein (c-FLIP). Alle Interaktionen am DISC basieren auf homophilen Proteinbindungen. Mittels seiner Todesdomäne wird FADD an CD95 rekrutiert und via seiner Todeseffektordomänen kommt es zur Rekrutierung von Procaspase-8 an den DISC. Die Rekrutierung von Procaspase-8 an den DISC führt zur autokatalytischen Spaltung und Bildung der aktiven Caspase-8. Diese wird ins Zytosol freigesetzt und initiiert Apoptose. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die CD95 N-Glykosylierung die Formierung des DISC und die damit verbundene Aktivierung der Procaspase-8 am CD95-DISC beeinflusst. Mittels Inhibitorstudien und der Herstellung von Glykosylierungsmutanten (N118Q and N136Q), sowie der Untersuchung von deglycosyliertem CD95 (durch Neuraminidase-Behandlung) konnte demonstriert werden, dass die N-Deglykosylierung von CD95 in einer verminderten Prozessierung von Procaspase-8 resultiert. Die Modellierung der CD95 DISC-Struktur und der Vernetzung mehrerer CD95-DISCs an einer Membran hat gezeigt, dass das Glykan, welches an N118 angeheftet ist, für den Kontakt zwischen benachbarten DISCs eine Rolle spielen kann. Auch an N136 befestigte Glykanreste könnten wichtig für die Komplexbildung und/oder die Stabilität von CD95 sein, da sie in der direkten Umgebung der CD95L Moleküle liegt. Diese Untersuchungen demonstrieren, dass die Glykosylierung von CD95 Einfluss auf die Bildung aktiver Caspase-8 hat, welche die Initierung des Zelltods bestimmt. Dies kann Bedeutung für die Entstehung von Krebszellen haben, da geringe Mengenunterschiede an aktiver Caspase-8 Überleben oder Tod der Zelle beeinflussen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Nickel, Prof. Dr. Walter
Date of thesis defense: 30 March 2010
Date Deposited: 25 May 2010 08:04
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: CD95 apoptotic pathway, caspase, glycosylation, apoptosis
Uncontrolled Keywords: CD95 apoptotic pathway , caspase , glycosylation
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