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Interplay between the transmembrane nucleoporin Pom121 and the Ran GTPase system

Yavuz, Emine Sevil

German Title: Wechselspiel zwischem dem Nucleoporin Pom121 and Ran GTPase System

PDF, English
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Ran GTPase has a well characterized role in interphase and metaphase. Due to high levels of RanGTP in proximity to chromatin, import receptors are dissociated from nuclear localization signal (NLS) bearing proteins in interphase and mitosis, thus facilitating both nuclear import and mitotic spindle assembly. In this thesis we investigated if Ran GTPase regulates the nucleoporin Pom121 through a similar mechanism during post-mitotic nuclear reassembly. We found that importin !/" interacts with both of the two predicted NLS sites of Xenopus Pom121 and is released by RanGTP. Importin !/" binding is completely abolished upon mutation of NLS sites, which also affected binding of a group of nucleoporins to Pom121. The NLS sites and transmembrane domain of Xenopus Pom121 are required for correct nuclear envelope (NE) localization of Pom121 in human U2OS cell lines. In these cells, RNAi depletion of human Pom121 greatly reduced cell viability and diminished the levels of a subset of nucleoporins detected by the monoclonal antibody 414 (mAb414). The signal was present, however, if the human Pom121 was knocked down in a cell line stably expressing wild-type Xenopus Pom121, while cell viability remained low. Furthermore, in the absence of human Pom121, stable expression of an NLS mutant form of Xenopus Pom121 decreased cell viability even more than U2OS cells depleted of endogenous Pom121. In cells depleted of human Pom121, expression of NLS mutant Xenopus Pom121 restored mAb414 levels as wildtype Xenopus Pom121 expressing cells. However, these NLS mutant Xenopus Pom121 expressing cells displayed decreased nuclear import kinetics compared to the cells expressing wildtype Xenopus Pom121. Electron microscopy analysis showed that wild-type Xenopus Pom121 localized at the NPCs in U2OS cells. In contrast, the NLS mutant Xenopus Pom121 localized in cytoplasmic membrane stacks interestingly together with other NPC components. Despite the presence of NPC components, these membrane stacks lacked NPC-like structures. Taken together, this data shows that the importin !/" binding sites on Pom121 are important for the NE localization of the protein and its interaction with other nucleoporins. A Pom121 mutant defective in importin binding results in nuclear transport defective pores and induces the formation of cytoplasmic membrane stacks which lack NPC-like structures. We propose that the importin !/"-Pom121 interaction is important for the formation of proper NPC function and structure at the NE and in cytoplasmic membrane stacks.

Translation of abstract (German)

RanGTPase hat eine gut charakerisierte Funktion in Interphase und Metaphase. Durch eine hohe Konzentration von RanGTP in der Nähe von Chromatin werden Importrezeptoren von Proteinen, die eine Zellkernlokalisationssequenz tragen, dissoziiert. Dies ermöglicht in Mitose den Spindelaufbau und Zellkerntransport in der Interphase. In dieser Arbeit wird untersucht, ob die GTPase Ran das Nucleoporin Pom121 in einer ähnlichen Weise reguliert. Wir haben herausgefunden, dass Importin !/"!mit jeder der beiden vohergesagten Zellkernlokalisationssequenzen von Xenopus Pom121 interagiert und dass diese Interaktion durch RanGTP aufgehoben wird. Die Mutation der Zellkernlokalisationssequenz unterbindet die Interaktion mit Importin!/"!komplett und beeinträchtigt auch die Bindung von einer Gruppe von Nucleoporinen an Pom121.Sowohl die Zellkernlokalisationssequenzen als auch die Transmembrandomäne von Xenopus Pom121 werden für die korrekte Zellkernmembran-Lokalisation von Pom121 in menschlichen U2OS Zellen benötigt. RNAi Depletion von menschlichen Pom121 reduziert die Vitalität dieser Zellen deutlich und vermindert das Signal einer Untergruppe von Nucleoporinen, die durch den monoklonalen Antikörper 414 (mAB414) detektiert werden. Jedoch ist das Signal klar erkennbar, wenn menschliches Pom121 in Zellen depletiert wurde, die stabil das wildtyp Xenopus Pom121 expremieren. Die Zellvitalität bleibt dagegen in diesen Zellen niedrig. Darüberhinaus vermindert die stabile Expression von einer in der Zellkernlokalisationssequenzen mutierten Form von Xenopus Pom121 die Zellvitalität in der Abwesenheit von humanen Pom121 noch stärker als die alleinige Depletion von endogenen Pom121. In Zellen, deren menschliches Pom121 depletiert wurde und die das in der Zellkernlokalisationssequenz mutierte Pom121 expremieren, ist das Ab414 Signal genauso hoch wie in Zellen, die wildtyp Xenopus Pom121 exprimieren. Doch diese das in der Zellkernlokalisationssequenz mutierte Pom121 expremierenden Zellen zeigen verlangsamte Import Kinetik verglichen zu den Zellen, die wildtyp Pom121 exprimieren. Elektronenmikroskopie-Analyse zeigt, dass wildtyp Pom121 interessanterweise in zytoplasmatischen Membranstapeln mit anderen Kernporenkomponenten lokalisiert. Abgesehen von der Anwesenheit der Bestandteile der Kernpore zeigen diese Membranstapel keine kernporenähnlichen Stukturen. Zusammendfassend zeigen diese Daten, dass Importina/b Bindestellenvon Pom121 wichtig für die Lokalisation des Proteins an der Zellkernmembran und seine Interaktion mit anderen Nucleoporinen sind. Eine Pom121 Mutante, deren Importinbindung defekt ist, resultiert in zellkerntransportdefekten Poren und induziert die Bildung von zytoplasmatischen Membranstapeln die keine kernporenähnlichen Strukturen aufweisen. Wir schlagen vor, dass die Importin a/b Pom121-Interaktion für die Bildung intakter Kernporenfunktion und -struktur an der Zellkernmembran und in zytoplasmatischen Membranstapeln wichtig ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mattaj, Prof. Dr. Iain W.
Date of thesis defense: 1 December 2009
Date Deposited: 28 May 2010 11:54
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Pom121 , nucleoporin , importins , nuclear envelope , NPC
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