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Quantitative analysis of the early steps of virus host cell interaction of human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis C virus

Eckhardt, Manon

German Title: Quantitative Analyse der frühen Schritte der Virus-Wirtszell-Interaktion des Humanen Immundefizienvirus und Hepatitis C Virus

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Abstract

Viruses are obligatory intracellular pathogens; hence an essential step of their replication cycle is the entry into a host cell. Enveloped viruses like the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and the hepatitis C virus (HCV) enter cells by fusion with cellular membranes. The current knowledge of this process relies mostly on bulk measurements, which often comprise the outcome of several distinct replication steps in a non-synchronized manner. The recent development of novel quantitative approaches has opened the door for deeper understanding of the process by analyses on a single cell and single particle level. Fluorescently labelled viruses allow studying single steps in the interaction of individual virions with the host cell. A strategy for labelling HIV-1 with organic dyes using the recently described SNAP-tag was established and evaluated in this thesis. Introduction of the SNAP-tag did not significantly interfere with virus entry and infectivity and allowed specific labelling of the Gag structural polyprotein in the context of virions and virus producing cells. Combining fluorescently labelled HIV-1 with the HCV pseudoparticle system (HCVpp) allowed the analysis of virion attachment and entry dependent on the envelope protein of HCV on a single particle level. In addition, the -Lactamase virion fusion assay was adapted to and optimized for HCVpp, allowing the detection of virus-cell fusion. The dependency of virus particle binding, endocytic uptake and fusion on various stimulating and inhibiting agents was investigated. The virus binding assay developed for HCVpp was subsequently adapted to HIV-1 and revealed cell-type specific kinetics of virion attachment. Interestingly, the expression level of the cellular virion tethering factor CD317 was shown to have no effect on exogenous virus binding. The main part of this thesis aimed at the acquisition and analysis of quantitative multi-parameter data of HIV-1 entry. Besides the receptor CD4, HIV-1 entry depends on the presence of either one of the two major co-receptors, CXCR4 or CCR5. The ability of a virus variant to use a co-receptor defines the tropism of the virus and is at least in part determined by the sequence of the third variable loop (V3-loop) of the viral envelope protein (Env). In summary, HIV entry efficiency is determined by a complex interplay between Env sequence, receptor and co-receptor densities. A deeper insight into the interdependencies of these critical parameters provides a basis for the understanding of the mechanism of action of HIV entry inhibitors as well as of pathways of resistance development against these compounds. Mathematical models describing the interdependencies will also aid in the refinement of algorithms for the genotypic prediction of co-receptor tropism, which is essential for the use of co-receptor antagonists in antiretroviral therapy. Here, experimental systems were developed which allow acquisition of detailed quantitative data on the interdependencies between these parameters as a basis for a mathematical model of the HIV-1 entry process. This comprised the selection and characterization of suitable model cell lines and experimental conditions, the generation and characterization of defined isogenic virus variants and the establishment and calibration of virological assay systems. Multivariant data sets were acquired under standard conditions and algorithms for multivariant data analysis which have been developed in collaboration with bioinformaticians were evaluated. A comprehensive data set was obtained by studying a subset of viruses carrying patient-derived Env variants which revealed quantitative differences in receptor and co-receptor dependency as well as sensitivity to prototype entry inhibitors beyond the overall results of common phenotyping/genotyping methods.

Translation of abstract (German)

Viren sind obligatorische Zellparasiten; der Eintritt in die Wirtszelle stellt daher einen essentiellen Schritt im Replikationszyklus jedes Virus dar. Umhüllte Viren wie das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) und das Hepatitis C Virus (HCV) treten durch Fusion der Virushülle mit einer zellulären Membran in die Wirtszelle ein. Bisherige Analysen des Viruseintritts beruhen überwiegend auf Ensemblemessungen, in denen oft mehrere aufeinanderfolgende Replikationsschritte in nicht synchronisierten Messungen zusammengefasst werden. Neuere Methoden erlauben jedoch die eingehende quantitative Analyse einzelner Replikationsschritte auf der Ebene einzelner Zellen und Partikel. Fluoreszenzmarkierte Viren ermöglichen es, die Interaktion einzelner Virionen mit der Wirtszelle zu visualisieren. In dieser Arbeit wurde eine Strategie zur Markierung von HIV mit synthetischen Fluoreszenzfarbstoffen durch Einführung des ‚SNAP-tags‘ entwickelt und evaluiert. Der SNAP-tag beeinträchtigte die virale Eintrittseffizienz und Infektiösität nur geringfügig und ermöglichte die spezifische Markierung von Viren und dem viralen Strukturprotein in virusproduzierenden Zellen. Durch Kombination fluoreszenzmarkierter HIV Partikel mit dem HCV Pseudopartikel-System (HCVpp) sowie durch Anpassung des -Lactamase Fusionsassays an HCVpp konnten einzelne Schritte des durch die HCV Hüllproteine vermittelten Eintrittsprozesses und deren Abhängigkeit von stimulierenden und inhibierenden Faktoren untersucht werden. Die Anwendung der zuvor mit HCVpp entwickelten Methode zur Untersuchung der Virusbindung auf HIV-1 zeigte zelltyp-spezifische Unterschiede in der Kinetik der Virusbindung. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Menge des zellulären Virusbindungsfaktors CD317 an der Zelloberfläche keine Rolle bei der Bindung exogener Viren spielt. Der Hauptteil dieser Arbeit befasst sich mit der Aufnahme und Analyse multivarianter Daten zum Zelleintritt von HIV. Neben dem Rezeptor CD4 benötigt HIV einen der beiden Korezeptoren CCR5 oder CXCR4. Der Tropismus für einen oder beide dieser Korezeptoren wird weitgehend von der Aminosäuresequenz in der 3. variablen Schleife (V3-loop) des HIV Hüllproteins (Env) bestimmt. Die Eintrittseffizienz des Virus wird von einem komplexen Zusammenspiel zwischen Env-Sequenz, Rezeptor- und Korezeptordichte bestimmt. Eine genauere quantitative Analyse dieser Abhängigkeiten ist die Grundlage für ein besseres Verständnis der Wirkungsweise von Inhibitoren des HIV Eintritts sowie der Entwicklung von Resistenzen gegen diese Präparate. Ein mathematisches Modell des Eintrittsprozesses wird auch zur Verbesserung von Algorithmen zur Vorhersage des Korezeptor Tropismus beitragen, die für den therapeutischen Einsatz von Korezeptor-Antagonisten essentiell ist. In dieser Arbeit wurden experimentelle Systeme entwickelt, die die Erhebung detaillierter quantitativer Daten zur Abhängigkeit der Eintrittseffizienz und Inhibitorsensitivität von Rezeptor- und Korezeptordichte erlauben. Dies umfasste die Auswahl und Charakterisierung geeigneter Modell-Zellinien, die Herstellung und Charakterisierung einer Auswahl isogener Virusvarianten, sowie die Etablierung und Kalibrierung virologischer Testsysteme. Diese Daten bilden die Grundlage zur Erstellung mathematischer Modelle des Eintrittsprozesses. Systematische multivariante Datensätze wurden aufgenommen und Algorithmen zur Datenanalyse wurden in Zusammenarbeit mit Bioinformatikern evaluiert. Die Analyse eines umfassenden Datensatzes zur Eintrittseffizienz von isogenen Viren mit aus Patientenisolaten gewonnenen viralen V3-loop Sequenzen ergab individuelle Eintrittsprofile der Virusvarianten, die durch bisher gebräuchliche Geno- und Phänotypisierungsmethoden nicht erfasst werden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kräusslich, Prof. Dr. Hans-Georg
Date of thesis defense: 12 May 2010
Date Deposited: 14 Jun 2010 09:12
Date: 2010
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Hygiene-Institut
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: HIV, Hepatitis-C-Virus, Quantitative Analyse, Genotypisierung, Virusrezeptor, CCR5-Rezeptor, Mathematische Modellierung
Uncontrolled Keywords: Viruseintritt , Virusbindung , Eintrittsinhibitorvirus entry , quantitative analysis , virus receptor , co-receptor , entry inhibitor
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