German Title: Die erwartete und unerwartete Rolle von Plasmodium Telomer-assoziierten Proteinen : Telomerase, SIR2A und SIR2B

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Abstract

Telomere begrenzen die Enden eukaryotischer Chromosomen und sind mit einer als Telosomen bezeichneten Gruppe von Proteinen bedeckt, die die Telomere vor deren Abbau schützen und somit die Stabilität des Genoms sicherstellen. In Plasmodium wurde ein hoch konserviertes Telosom Protein identifiziert, das histone (protein) deacetylase silent information regulator 2 Protein (PfSIR2A) und sein Homolog SIR2B. Das P. falciparum SIR2A Protein scheint eine kritische Rolle bei der Regulation von Multigen Familien (z. B. var Gene) zu spielen, die in den Prozess der Antigenvariation involviert sind, ein Mechanismus der es pathogenen Organismen erlaubt ihre Oberflächenantigene zu verändern um dem Immunsystem ihres Wirts zu entgehen. Eine Deletion von Pfsir2a oder Pfsir2b führt zur Hochregulierung der Transkription bestimmter var Gene in den jungen asexuellen Blutstadien. Orthologe der beiden sir2 Gene von P. falciparum wurden in allen Plasmodium Arten gefunden, deren Genome bis dato sequenziert wurden, einschliesslich dem des Nagerparasiten P. berghei. Drei P. berghei Zelllinien wurden generiert und geklont: Pbsir2a, Pbsir2b, Pbsir2a/b. In der Maus wurden keine Veränderungen beim Wachstum der asexuellen Blutstadien, der Vermehrungsrate oder der Virulenz der drei mutierten Parasitenlinien beobachtet. Die Analyses des Transkriptoms der asexuellen Blutstadien der Doppel-Nullmutante (Pbsir2a/b) zeigte eine Deregulierung von Genfamilien in der sub-telomer Region (bir, Pb-fam), die mit dem Prozess der Antigenvariation in Verbindung stehen und bestätigte die Art der Genregulation durch SIR2, die für P. falciparum gezeigt wurde. Die Deletion von Pbsir2b hatte keinerlei Effekt auf das Wachstum der Parasiten während des gesamten Lebenszyklus, weshalb eine essenzielle Rolle des SIR2B Proteins für die Entwicklung der Moskito und Leberstadien ausgeschlossen werden kann. Die Deletion des Pbsir2a Gens führte jedoch zu einer unerwarteten Blockade der Entwicklung der Parasiten im Moskito beim Übergang vom Ookineten zum Oozysten Stadium. Bei der Analyse transgener Parasiten die eine GFP-markierte Form von PbSIR2A exprimieren, beobachteten wir eine bisher nicht charakterisierte Lokalisierung ausserhalb des Zellkerns am apikalen Pol der Ookinete. Morphologische Studien und die Untersuchung der Verteilung und Konzentration mehrerer micronemaler Proteine sowie einleitende Untersuchungen des Acetylierungsstatus von Proteinen in den mutierten Ookineten deuten auf eine aberrante Funktion des apikallen Apparates hin, welche womöglich einen minimalen Effekt auf die Motilität der Ookinete hat. Diese Ergebnisse weisen auf eine mögliche Funktion von SIR2A während der Anheftung/ Invasion/ Durchquerung der Ookinete durch die Mitteldarmwand des Moskitos hin. Ein weiteres Protein das für die Funktion der Telomere kritisch ist, ist das hoch konservierte Telomerase Holoenzym, welches für den Erhalt der Länge der Telomere wichtig ist. Bei jeder Zellteilung werden die Telomere aufgrund des Problems der End-Replikation verkürzt. Die Ribonukleoprotein Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) ist die zentrale Untereinheit des Telomerase Komplexes und fügt den G-reichen 3’ Enden der Chromosomen neue repetitive Oligomere hinzu. Dadurch wird ein vorzeitiges Altern und letztendlich der Zelltod (verzögerter lethaler Phenotyp) verhindert, wie er in TERT und TR- defizienten Pflanzenzellen, Hefen, Protozoen und Säugerzellen beschrieben wurde, bei denen die Telomerase in erster Linie für den Erhalt funktioneller Telomere verantwortlich ist. Die Länge der Telomere in Plasmodium ist stabil während der Blutzellstadien und die Aktivität der TERT ist nachweisbar während der Trophozoiten- und Schizontenstadien, in denen die Replikation der DNA stattfindet. TERT wurde weithin als mögliches Zielmolekül für die Entwicklung von Medikamenten beispielsweise gegen Krebszellen untersucht und eine Inhibierung des Tumorwachstums konnte gezeigt werden. Vorläufige, bisher nicht publizierte Daten über den Effekt von Nucleosid-Analogen auf P.falciparum in vitro Kulturen zeigen einen lethalen Effekt auf die Blutstadien der Parasiten nach 3-5 Zyklen bei micromolaren Konzentrationen (A. Scherf, Institute Pasteur). Eine kürzlich veröffentlichte Evaluierung verschiedener Komponenten deutet auf eine hohe anti-plasmodiale Aktivität von Delarvidine in vitro gegen Leberstadien von P. yoelii hin. Zusätzlich zu diesen Daten kann ein negativer Effekt durch das Fehlen von TERT bei Deletionsversuchen in P. berghei beobachtet werden. Obwohl die Anwesenhiet von tert- Parasiten in der anfänglichen Population direkt nach der Transfektion beobachtet wurde, konnten keine tert- Klone gewonnen werden. Dies ist in Übereinstimmung mit dem verzögerten lethalen Phenotyp, der in anderen Organismen beobachtet wurde. Die gewonnenen Resultate zeigen das TERT für die Entwicklung von Plasmodium essentiell ist und kennzeichnen Anti-Telomerase Medikamente als mögliche Hilfsmittel bei der Behandlung von Malaria Erkrankungen.

Translation of abstract (English)

Telomeres define the ends of eukaryotic chromosomes, and are covered by a number of proteins (collectively called the telosome), which protect the telomeres from degradation, thereby ensuring genome stability. One highly conserved telosome protein identified in Plasmodium is a histone (protein) deacetylase silent information regulator 2 (PfSIR2A) and its distant homologue SIR2B (PfSIR2B). The P. falciparum SIR2A appears crucial in the regulation of multigene families (e.g. var genes) involved in a process called antigenic variation, which is the mechanism in which pathogenic organisms alter their surface antigens in order to evade the host immune system. Deletion of either Pfsir2a or Pfsir2b causes transcriptional up-regulation of distinct types of var genes in the early asexual blood stages. Orthologues of the two P. falciparum sir2 genes have been identified in all genome-sequenced Plasmodium species, including the rodent malaria parasite P. berghei. Three P. berghei lines lacking Pbsir2a, Pbsir2b and uniquely lacking sir2a and sir2b genes were obtained and cloned. When propagated in mouse infections no gross alterations were observed in asexual blood stage growth, multiplication or virulence of all 3 parasite mutants. Global transcriptome analysis of asexual blood stages of the double deletion mutant (Pbsir2a-/Pbsir2b-) demonstrated deregulation of subtelomeric gene families (bir, Pb-fam) implicated in the process of antigenic variation, confirming the mode of gene regulation exercised by SIR2 shown in P. falciparum. Pbsir2b deletion had no effect on parasite growth throughout the complete life cycle excluding an essential role for SIR2B in parasite development in the mosquito and host liver. Unexpectedly, development of parasites lacking PbSIR2A was completely blocked in the mosquito host at the ookinete-to-oocyst transition. Using transgenic parasites expressing a GFP-tagged PbSIR2A protein we found a hitherto uncharacterised non-nuclear localisation focused to the apical end of the ookinete. Moreover, morphological analysis and examination of the distribution and concentration of several micronemal proteins as well as a preliminary examination of general protein acetylation status in mutant ookinetes suggests an aberrant functioning of the apical apparatus that might minimally affect ookinete motility. These results imply that SIR2A might play a role during attachment/invasion/traversal of the ookinete of the mosquito midgut wall. Another protein of crucial importance to telomere biology is the highly conserved telomerase holoenzyme, which functions as “telomere length guard”. With each cell division telomeres shorten due to the so-called end-replication problem. The ribonucleoprotein telomerase reverse transcriptase (TERT) – the core subunit of the telomerase complex adds new telomeric repeats to the 3’ G-rich chromosome end, preventing premature cell senescence and eventual death (the delayed death phenotype), observed in TERT- and TR-deficient cells of plants, yeast, protozoa and mammals, in which telomerase is the major player in telomere maintenance pathway. Plasmodium telomere length is stably maintained during blood stage proliferation, and TERT activity is detectable at the trophozoite and schizont blood stages where DNA replication occurs. TERT has been widely explored as a drug target in e.g. cancer cells, and was shown to effectively inhibit cancer growth. Unpublished preliminary data from the nucleoside analogue drug testing on P. falciparum in vitro culture show parasites are killed after 3 – 5 blood stage cycles at micromolar concentrations (A. Scherf, Institute Pasteur). A recently published evaluation of several compounds indicated that delavirdine (a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor) has high anti-malarial activity in vitro against liver stage of P. yoelii. In support of these data, negative effects of TERT absence can be seen from attempts to delete P. berghei tert. Despite the presence of tert- parasites in the initial transfection population, the tert- clones could not be obtained, which is in agreement with the expected delayed death phenotype, observed in other organisms. A more extensive cloning of the parasites revealed no positive clones. The obtained results prove TERT to be essential in Plasmodium development and designate anti-telomerase drugs as plausible auxiliaries in the treatment of malaria infections.