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Genetic modification of oncolytic adenoviruses for anti-cancer-therapy

Quirin, Christina

German Title: Genetische Modifikation von onkolytischen Adenoviren zur Krebstherapie

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Abstract

Recombinant adenoviruses (Ad) have emerged as promising agents in therapeutic gene transfer, genetic vaccination and virotherapy. Virotherapy is defined as killing of cancer cells by specific virus infection, replication, cell lysis and virus spread by so called oncolytic viruses. “Armed” oncolytic Ad in which a therapeutic gene is genetically engineered into the virus and dependent on the tumour-selective replication of the virus for expression, represent a new and promising strategy for cancer treatment. This was achieved by using either an internal ribosomal entry site, a ‘self-cleaving’ 2A peptide or by an additional splice acceptor site to insert the reporter gene luciferase into the late transcription unit. In addition, I engineered novel melanoma-targeted, conditionally replicative Ad by replacing the promoter of the essential viral gene E1A with a cassette containing a human tyrosinase enhancer/promoter construct. While all oncolytic adenoviruses showed nearly similar cytotoxicity in melanoma cells, the melanoma specific Ads had a 10 – 1000 fold lower cytopathic effect in cell lines derived from various nonmelanocytic tissues. I showed that the mode of transgene expression and the locale of transgene insertion into the virus genome critically determine the efficacy of this approach. The most specific transgene expression (up to 1500 fold) was observed for an Ad which combines the tyrosinase promoter and the transgene expression by alternative splicing. In summary, I could show that transcriptional targeting combined with splice acceptor site mediated transgene expression is feasible and results in the highest levels of selectivity for replication and transgene expression. To combine the benefit of viral oncolysis with molecular chemotherapy, I inserted a suicide gene for gene directed enzyme prodrug therapy via optimized splice acceptor site into the virus genome. This approach resulted in indirect transcriptional targeting of genetic prodrug activation by the “armed”, melanoma specific Ad as well as in increased therapeutic effect of the oncolytic Ad. Therapeutic applications of Ad would benefit form a targeted virus cell entry into cancer cells. Such tropism-modification of Ad requires the ablation of their natural cell binding properties and the incorporation of cell-binding peptides. The short capsid fiber proteins of Ad subgroup F has recently been suggested as a tool for genetic Ad detargeting based on the reduced liver infectivity of corresponding fiber chimeric Ad-vectors in vitro and in vivo. Based on previous studies to determine functional insertion sites for peptide ligands into the Ad41 short fiber of Ad-vectors, I investigated the lytic potency of oncolytic Ad engineered with peptide ligands inserted in the Ad41 fiber. With the RGD model peptide I could demonstrate that the production of oncolytic Ad with ligands inserted into different loops of the fiber is feasible. Depending on the insertion site, viral replication, early and late viral gene expressions of the fiber-chimeric Ad differs in comparison to matching control viruses, carrying the same ligand in the HI loop of Ad5 fiber. The cytotoxicity of fiber-chimeric viruses is reduced irrespective of the insertion site. The results indicate that a decreased or delayed virus assembly could be a reason for my observation. Furthermore, I used fiber-chimeric virus as a novel platform for genetic targeting of Ad cell entry. I generated an ablated virus which targets EphA2 receptor expressing melanoma cells via inserted EphA2 peptide ligand. However, the lytic potency of the chimeric fiber Ad was significantly reduced compared to the matching control virus. Summarized, I developed an oncolytic Ad which combined effective oncolysis with targeted prodrug activation therapy of melanoma and I generated an oncolytic Ad showing peptide-dependent cell entry for targeted oncolysis of melanoma.

Translation of abstract (German)

Typische Merkmale von Krebserkrankungen sind unkontrolliertes Wachstum, Streuung der Tumorzellen in umliegende Gewebe und letztlich auch die Resistenz gegen verschiedene Therapieansätze. Besonders letzteres zeigt den Bedarf an neuen, innovativen Behandlungsmöglichkeiten wie die adenovirale Onkolyse. Dabei werden Tumorzellen mit tumorspezifisch replikationsfähigen oder onkolytischen Adenoviren (Ad) infiziert und durch deren lytischen Replikationszyklus zerstört. Die Expression therapeutischer Gene mit Hilfe von onkolytischen Ad ist ein neues und vielversprechendes Konzept zur Behandlung von Krebs. Neben der Art des Transgens ist die Effizienz und Kinetik der Transgenexpression entscheidend. Das Ziel des Projektes war es das Transgen so in das virale Genom zu inserieren, dass seine Expression nach der viralen Replikation erfolgt. Diesbezüglich habe ich das Reportergen Luziferase mit Hilfe einer Internen Ribosomen Bindungssequenz, einer selbst spaltenden 2A-Sequenz oder einer zusätzlichen Spleiß-Akzeptor Sequenz in die späte Transkriptionseinheit des adenoviralen Genoms eingefügt. Für eine Melanom-spezifische, virale Replikation ersetzte ich den Promotor des essentiellen viralen Gens E1A durch den Melanom-spezifischen Tyrosinase Promotor. Während alle onkolytischen Ad dieselbe Zytotoxizität in Melanomzellen zeigten, war der lytische Effekt der Melanom-spezifischen Viren in nicht melanotischem Gewebe um den Faktor 10 – 1000 reduziert. Meine Ergebnisse zeigten, dass die Spezifität der Transgenexpression von der Strategie der Transgeninsertion im Virusgenom abhängt. Die höchste Spezifität der Luziferasexpression konnte für die Kombination von transkriptionellem Targeting und Transgenexpression mittels alternativen Spleißens gezeigt werden. Zur Verknüpfung von Virustherapie und molekularer Chemotherapie inserierte ich ein Prodrug-aktivierendes Gen mittels optimierter Spleiß-Akzeptor Sequenz in das virale Genom. Dieser Ansatz resultierte in indirektem, transkriptionellem Targeting der genetischen Prodrug-Aktivierung und zeigte eine verbesserte Effizienz der Onkolyse in der Kombinationstherapie. Die therapeutische Anwendung von onkolytischen Ad würde deutlich von einem gerichteten Tumorzelleintritt profitieren, der durch den natürlichen Ad Tropismus nicht gegeben ist. Dies erfordert die Ablation des nativen Ad Tropismus und den Einbau Zell-bindender Liganden. Die kurzen Fiberproteine des Ad41 (Ad41s) Kapsids konnten bereits aufgrund ihrer reduzierten Lebertransduktion erfolgreich als Ausgangsformat für die Tropismusablation eingesetzt werden. Basierend auf Studien bezüglich Insertionspositionen für Peptidliganden im Ad41s Fiberprotein war mein Ziel den Replikationszyklus von Ad mit derartigen Kapsidmodifikationen zu untersuchen. Mittels des Modellpeptides RGD konnte die Produktion der onkolytischen Ad, welche eine interne RGD Insertion in unterschiedlichen Loops des Fiberproteins aufweisen, gezeigt werden. Abhängig von der Insertionsposition hat sich die Genexpression der frühe und späte viralen Gene der Fiber-Chimären Ad deutlich unterschieden. Die Viren wiesen im Vergleich zum Wildtyp Ad5 eine reduzierte Zytotoxizität auf, welche unabhängig von der Insertionsposition des Peptids war. Die Ergebnisse deuten auf eine reduzierte oder verspätete Viruszusammensetzung hin. Für den gerichteten Krebszelleintritt wurde ein kürzlich beschriebenes, EphA2-bindendes Peptid in eine definierte Position des Ad41s Fiberproteins eingebaut. Das resultierende Virus konnte spezifisch EphA2-positive Zellen infizieren, aber es wies im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle ein deutlich geringeres lytisches Potential auf. Die Kombination von effektiver Onkolyse mit einer gerichteten Gentherapie konnte in dieser Arbeit eindrucksvoll gezeigt werden. Des Weiteren liefert diese Studie wichtige Grundlagen für die Entwicklung von Peptid-abhängigem Zelleintritt onkolytischer Ad.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Özbek, Dr. PD Suat
Date of thesis defense: 23. June 2010
Date Deposited: 19. Jul 2010 08:09
Date: 2010
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: adenovirus , anti-cancer-therapy
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