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Identifikation von Zielgenen des Transkriptionsfaktors SHOX in der Gliedmaßenentwicklung

Decker, Eva

English Title: Identification of SHOX target genes during limb development

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Abstract

Das Gen SHOX (short stature homeobox gene) codiert für einen Transkriptionsfaktor, der für eine korrekte Entwicklung der Gliedmaßen notwendig ist. So führt eine SHOX-Defizienz im Menschen zu verschiedenen Kleinwuchssyndromen, bei denen neben genereller Verkürzung insbesondere des Zeugopodiums (Unterschenkel und Unterarm) auch Fehlbildungen des Handgelenks auftreten können (Leri-Weill-Dyschondrosteosis, Langer-Syndrom, Idiopathischer Kleinwuchs, Turner-Syndrom). Bisher ist mit BNP nur ein SHOX-Zielgen beschrieben worden, doch die molekularen Konsequenzen dieser Regulation sind noch unklar. Ziel der vorliegenden Arbeit war, weitere von SHOX regulierte Gene zu identifizieren, um die Rolle von SHOX während der Gliedmaßenentwicklung besser zu verstehen. In Microarrays und verschiedenen Zellkulturexperimenten wurde ein stark positiver Einfluss von SHOX auf die Expression von FGFR3 und RUNX3 gefunden. Beide Gene codieren für bekannte Faktoren in Gliedmaßenentwicklung und Knochenbildung. Luciferase-Reportergen-Assays in mehreren Zelllinien zeigten einen stark aktivierenden Effekt von SHOX auf den erweiterten FGFR3-Promotor. Auf den RUNX3-Promotorbereich wirkte SHOX ebenfalls moderat aktivierend. ChIP- und EMSA-Ergebnisse lassen vermuten, dass die Regulation von RUNX3 indirekt ist, wäh¬rend SHOX direkt an den erweiterten Promotor von FGFR3 binden kann. Zur Untersuchung dieser Regulationen in der Gliedmaßenentwicklung wurden Experimente in mehreren Modellsystemen zur Chondrozytendifferenzierung durchgeführt. Für RUNX3 konnte in diesen Systemen keine reproduzierbare, SHOX-abhängige Regulation gezeigt werden; möglicherweise ist die in den Zelllinien gefundene Regulation in anderen Geweben oder zu anderen Entwicklungszeitpunkten relevant. FGFR3 wurde jedoch in sogenannten Hühner-Micromass-Kulturen, bei denen embryonale Mesenchymzellen aus den sich entwickelnden Gliedmaßen zu Chondrozyten differenzieren, durch virusvermittelte SHOX-Überexpression herunterreguliert. Diese negative Regulation konnte mittels qRT-PCR und in situ-Hybridisierung nachgewiesen werden und würde eine Erklärung für die sich überwiegend ausschließenden Expressionsmuster beider Gene in den Extremitäten von Hühnerembryonen bieten. Wenn man davon ausgeht, dass die gefundene negative Regulation vor allem im Zeugopodium stattfindet, wie es anhand des Expressionsmusters von SHOX anzunehmen ist, ergibt sich außerdem eine mögliche Erklärung für die bei FGFR3- und SHOX-Mutationen beobachteten Phänotypen im Menschen. So führen FGFR3-Gain-of-Function-Mutationen durch vorzeitige Schließung der Wachstumsfugen zu Zwergwuchs, bei dem vor allem die Knochen des Stylopodiums (Oberschenkel und Oberarm) betroffen sind, während eine SHOX-Defizienz eine Verkürzung insbesondere des Zeugopodiums auslöst. Eine SHOX-Defizienz würde entsprechend der in dieser Arbeit formulierten Hypothese, dass SHOX FGFR3 im Zeugopodium negativ reguliert, zu einer erhöhten Menge von FGFR3 in Ulna und Radius sowie Tibia und Fibula führen, was dort eine schnellere Schließung der Wachstumsfuge und damit die relative Verkürzung dieser Knochen bedingen würde. Andererseits würde SHOX generell die Expression von FGFR3 im Zeugopodium niedriger halten als im Stylopodium, weshalb FGFR3-Gain-of-Function-Mutationen in Humerus und Femur einen stärkeren Effekt zeigen. Klinische Daten aus Patienten, die Mutationen in FGFR3 als auch in SHOX tragen, unterstützen diese Hypothese.

Translation of abstract (English)

The gene SHOX (short stature homeobox gene) encodes a transcription factor important in limb development. In human, SHOX deficiency has been associated with different short stature syndromes including Leri-Weill dyschondrosteosis, Langer mesomelic dysplasia, idiopathic short stature and Turner syndrome. A common feature in these syndromes is a disproportionate short stature with a particular shortening of the long bones of the zeugopod (forearm and lower leg) as well as a characteristic abnormality of the forearm called Madelung deformity. To date, BNP is the only published target gene of SHOX, but the molecular consequences of this regulation are still unclear. The aim of the present study was to identify additional genes that are regulated by SHOX during limb development in order to extend our knowledge of this process. Microarray analyses and different cell culture experiments revealed a strong positive effect of SHOX on the expression of FGFR3 and RUNX3. Both genes encode factors that are well known for their role during limb development and ossification. Using luciferase reporter gene assays in different cell lines, SHOX was able to strongly activate the extended FGFR3 promoter. The RUNX3 promoter was also moderately activated by SHOX. Results from ChIP and EMSA experiments suggest an indirect regulation of RUNX3, whereas SHOX presumably binds directly to the extended FGFR3 promoter. To investigate these regulations in limb development, different model systems for chondrocyte differentiation were established. RUNX3 did not show a reproducible SHOX-dependent regulation in any of these systems. Thus, the regulation initially found in cell lines may have a role in a different tissue or at a different developmental stage. FGFR3, however, was negatively regulated by viral overexpression of SHOX in chicken micromass cultures, where embryonic mesenchymal stem cells isolated from limb buds differentiate into chondrocytes. The downregulation in chicken micromass cultures was demonstrated by qRT-PCR and in situ hybridization and might explain the almost mutually exclusive expression patterns of FGFR3 and SHOX seen in embryonic chicken limbs. In agreement with the known SHOX expression regions in the limb, this negative regulation would occur mainly in the zeugopod and therefore offer a possible explanation for the phenotypes seen in patients with FGFR3 and SHOX mutations. It is known that FGFR3 gain of function mutations lead to premature fusion of the growth plates and thereby to dwarfism phenotypes which affect particularly the stylopod (upper arm and thighs), whereas SHOX deficiency causes a shortening of the zeugopod. According to the hypothesis that FGFR3 is downregulated by SHOX in the zeugopod, SHOX deficiency would increase the FGFR3 expression level in ulna and radius as well as tibia and fibula, which would accelerate the growth plate fusion and lead to a relative shortening of these bones. Normal SHOX levels would generate a lower expression of endogenous FGFR3 in the zeugopod compared to the stylopod; therefore, FGFR3 gain of functions mutations would be more likely to have a strong effect in humerus and femur. Clinical data from patients carrying mutations in both FGFR3 and SHOX support this hypothesis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Steinbeisser, Prof. Dr. Herbert
Date of thesis defense: 23 July 2010
Date Deposited: 26 Jul 2010 15:26
Date: 2010
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Humangenetik
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Knochenbildung, Gliedmaßen, Minderwuchs, Transkriptionsfaktor
Uncontrolled Keywords: SHOX , FGFR3SHOX , limb development , short stature , transcription factor , FGFR3
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