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KCC2 plays a crucial role during the maturation of spinal neurons by regulating the expression of the GlyR alpha subunit and gephyrin

Schumacher, Stefanie Birgitta

German Title: KCC2 spielt eine entscheidende Rolle bei der Reifung von spinalen Neuronen durch die Regulation der GlyR Alpha Untereinheiten-Expression

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Abstract

In spinal cord and brain stem, the GlyR is the major receptor type to mediate inhibitory synaptic transmission. Together with the GlyRb subunit, the GlyRa1 subunit forms the adult form of the receptor. Activation of the pentameric GlyR by glycine results in an increased permeability of the GlyR channel for chloride. In juvenile stages, the cell is depolarized whereas adult neurons experience a hyperpolarization. Not least, the activity of KCC2, changing the intracellular chloride level from a high to a low adult state, contributes considerably to the maturation of the neurons. In this thesis, the approximate time point of the switch to occur in vitro could be determined to div 14 via mRNA expression studies of the distinct GlyR subunits. The obtained mRNA data also indicate that the GlyRb subunit exhibits the highest RNA expression whereas GlyRa1 expression is even lower than that of GlyRa2. Taken together, the results suggest that adult neurons as well as juvenile neurons still express heteromeric α2β and/or homomeric α2 receptors. Strychnine application to the SN cultures resulted in a down regulation of KCC2 expression in a dose-dependent manner at div 14. This finding indicates that the activity of the GlyR may regulate the expression of KCC2 to some extent. Subsequent treatments with Ca2+ channel blockers and Ca2+ chelators revealed a role for Ca2+ to destabilize the KCC2 complex. Although suppression of the entire synaptic transmission in the culture by TTX application as well as catching all free Ca2+ ions also reduce KCC2 expression, the latter seems not to be dependent on Ca2+ influx via L-type channels. However, KCC2 expression either depends on Ca2+ being present within the cell or Ca2+ influx through another type of Ca-channel than L-type. To clarify the role of KCC2 in the GlyR subunit switch, its expression successfully was down regulated upon transduction by a silencing shRNA construct. Immunoblot and localization of immunoreactivities reveal a decrease in the expression of the adult GlyRa1 subunit following KCC2 knockdown. The expression of gephyrin is affected as well. In the main, no additionally investigated synaptic proteins are concerned. Therefore, the neurons are supposed to remain in a juvenile state in terms of the GlyR when KCC2 is not expressed properly. The question arising is, whether the pure presence or the activity of KCC2 is responsible for the correct GlyRa1 expression. It also remains unclear whether knockdown of KCC2 affects GlyRa1 expression and hence gephyrin expression, the other way around or whether even both proteins directly are affected by loss of KCC2. I suggest that loss of KCC2 impairs the expression of the scaffolding protein gephyrin via unknown cytoskeletal mechanisms or signalling pathways. The absence of gephyrin in turn directs loss of the adult GlyR consisting of GlyRa1 and GlyRb. This loss might result from either down regulation of GlyRa1 expression or removal of the adult receptor from the membrane and subsequent degradation.

Translation of abstract (German)

Im Rückenmark und im Hirnstamm ist hauptsächlich der Glyzin Rezeptor (GlyR) als inhibitorisch agierender Rezeptortyp exprimiert. Die GlyRb und die GlyRa1 Untereinheiten formen zusammen den adulten Rezeptor. Wird der pentamere GlyR durch Glyzin aktiviert, erhöht sich seine Permeabilität für Chlorid, wodurch im Adultstadium eine Hyperpolarisation der postsynaptischen Membran hervorgerufen wird. Im Jugendstadium dagegen erfährt die Zelle eine Depolarisation und somit eine exzitatorische Antwort. Durch die drastische Verringerung des hohen, intrazellulären Chloridlevels trägt die Aktivität von KCC2 nicht zuletzt auch zur Reifung der Neurone bei. In dieser Arbeit konnte ein etwaiger Zeitpunkt des GlyR Untereinheiten Switch determiniert werden. In vitro Daten aus mRNA Expressionsstudien der unterschiedlichen Untereinheiten zufolge findet der Switch um den Zeitpunkt div 14 statt. Aus den besagten Daten geht auch hervor, dass die GlyRb Untereinheit die höchste mRNA-Expression aufweist, wogegen das GlyRa1-Expressionslevel sogar unter dem von GlyRa2 liegt. Zusammenfassend lässt sich aussagen, dass auch reife Neurone aus dem Rückenmark noch heteromere α2β und/oder homomere α2 Rezeptoren exprimieren. Behandelt man die SN Kulturen mit Strychnin, tritt eine dosisabhängige Abnahme der KCC2-Expression an div 14 auf. Daraus kann man schließen, dass die KCC2-Expression in gewissem Maße durch die Aktivität des GlyRs reguliert wird. Anschließend wurden die Zellen mit Ca2+-Kanal Blockern und Ca2+-Chelatbildnern behandelt. Daraus geht hervor, dass Ca2+ möglicherweise dazu imstande ist, den KCC2-Komplex, der nur als Tetramer aktiv ist, zu destabilisieren. Obwohl die Inhibierung der gesamten synaptischen Transmission der Kultur durch TTX als auch das Komplexieren aller freier Ca-Ionen zu einer verminderten KCC2-Expression führt, scheint letzteres nicht vom Ca2+-Einstrom durch L-Typ Kanäle abhängig zu sein. Dennoch hängt die KCC2 Expression entweder von freien Ca2+-Ionen innerhalb der Zelle oder von einströmendem Ca2+ durch andere Kanäle ab. Um die Rolle von KCC2 im GlyR Untereinheiten Switch zu klären, wurden die Neurone mit einem shRNA Konstrukt transduziert, das die Expression von KCC2 fast komplett still legt. Eine daraus folgende Verminderung der adulten GlyRa1 Untereinheiten-Expression konnte in Immunoblots und Immunfärbungen aufgezeigt werden. Ebenso betroffen von dem KCC2 Knockdown war Gephyrin, welches den adulten GlyR am Zytoskelett verankert. Im Großen und Ganzen wurden alle anderen untersuchten synaptischen Proteine nicht durch den KCC2 Knockdown beeinträchtigt. Daraus folgt, dass die Zellen, im Bezug auf den GlyR, in einem jugendlichen Stadium verharren, wenn KCC2 nicht im richtigen Ausmaß exprimiert wird. Daraus resultiert die Frage, ob die bloße Anwesenheit von KCC2 oder seine Aktivität verantwortlich für die korrekte GlyRa1-Expression ist. Es bleibt auch unklar, ob der Knockdown von KCC2 die GlyRa1 Untereinheiten-Expression direkt und daraus folgend die Gephyrin-Expression beeinträchtigt oder umgekehrt oder ob sogar beide Proteine direkt durch den Verlust der KCC2-Expression betroffen sind. Meine Vermutung ist, dass der Verlust an KCC2 das gerüstbildende Protein Gephyrin über bisher unbekannte Zytoskelett-Verbindungen oder Signalwege in Mitleidenschaft zieht. Der Verlust an Gephyrin wiederum führt zu einer Verminderung des adulten GlyRs, bestehend aus GlyRa1 und GlyRb. Diese Verminderung könnte entweder aus der Abnahme der GlyRa1-Expression oder aus der Entfernung des GlyRs aus der Membran und anschließender Degradierung resultieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bading, Prof. Dr. Hilmar
Date of thesis defense: 27 July 2010
Date Deposited: 30 Jul 2010 11:58
Date: 2010
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Anatomie und Zellbiologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Nervennetz, Rückenmark, Glycine
Uncontrolled Keywords: KCC2 , Glyzin RezeptorKCC2 , glycine receptor , spinal neurons
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