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Analysis of Infection Relevant Protein Domains of the Adeno-Associated Virus Serotype 8 in Comparison to Serotype 2

Raupp, Christina

German Title: Analyse Infektions-relevanter Proteindomänen des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 8 im Vergleich zum Serotyp 2

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Abstract

Ausgangspunkt für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen war die außergewöhnlich hohe Gentransduktionseffizienz von AAV8 Vektoren. Ein Vergleich zwischen AAV2 und AAV8 konnte zeigen, dass sich grundlegende Unterschiede auf den Kapsid Oberflächen befinden, trotz einer 83 % Homologie auf der Proteinsequenzebene zwischen beiden Serotypen. Ziel dieser Studie war es, die Rolle verschiedener Kapsidabschnitte beim Gentransfer zu charakterisieren. In Mutanten waren entweder große Sequenzabschnitte zwischen AAV2 und AAV8 oder einzelne Aminosäuren von AAV2 nach AAV8 oder von AAV8 nach AAV2 ausgetauscht worden. Das Ersetzen von großen AAV2 Kapsiddomänen im AAV8 Kapsid zeigte, dass insbesondere ein Sequenzabschnitt, der in die Bildung der Kapsidoberfläche involviert ist, einen großen Einfluss auf die Gentransduktion von AAV8 hatte. Der Austausch von einzelnen Aminosäuren in dieser Region des Kapsids verursachte für AAV8, sowie auch für AAV2 Partikel, einen starken Einfluss auf die Genexpression in vivo. Im Vergleich zum Wildtyp AAV8 Kapsid konnten Kapsidoberflächenmutanten eine Transduktionssteigerung, aber auch eine Transduktionssenkung induzieren. Eine Substitution, die sich im Inneren des Kapsidmantels befand, verursachte einen vollständigen Verlust der Gentransduktion mittels AAV8 Vektoren. Hingegen konnte eine weitere Substitution, die an der inneren Schulter der "Kapsid-Spikes" generiert worden war und Heparinbindung für das AAV8 Kapsid erzeugt hatte, die Transduktionseffizienz von AAV8 noch steigern. Überraschenderweise konnte eine reverse Substitution von AAV2 Aminosäuren durch Aminosäuren von AAV8 im Bereich der inneren Schulter der "Spikes" ebenfalls zu einer Steigerung der Gentransduktion von AAV2 -teilweise sogar auf das Niveau von AAV8 - bewirken. Nach der Analyse von Domänen, die die Gentransduktion von AAV8 beeinflussen, wurde in das AAV8 Kapsid eine Insertionsstelle eingefügt, um zu testen, ob das Kapsid aufgrund von insertierten Peptidsequenzen sein "Targetingprofil" verändert. Bekannte Peptidsequenzen, die in AAV2 Vektoren ein "Retargeting" bewirkt hatten, konnten auch im AAV8 Kapsid ein verändertes "Targeting" verursachen. Eine AAV8 Bibliothek mit zufälligen Peptidsequenzen in dieser Insertionsstelle wurde für die Selektion von Leber-spezifischen Vektoren verwendet. Es wurden Peptidmotive isoliert, die den unerwünschten Gentransfer von AAV8 Vektoren auf andere Organe als Lebergewebe drastisch reduzierten. Studien mit einem monoklonalen Antikörper gegen AAV8 Kapside zeigten, dass dieser an dieselbe Stelle im AAV8 Kapsid bindet, in welche die Peptide insertiert wurden und welche nach Austausch gegen AAV2 Aminosäuren zu einer Transduktionssteigerung führte. Die Bindung der Antikörper an das Kapsid neutralisierte die Infektion, verhinderte aber nicht die Virusaufnahme in die Zelle. Der Mechanismus der Neutralisierung konnte jedoch nicht vollständig aufgeklärt werden.

Translation of abstract (English)

The starting point of this work was the analysis of the unusually high gene transduction efficiency of AAV8 vectors. A comparison between AAV8 and AAV2 revealed fundamental differences of the capsids even though an 83 % homology is shared in the VP protein sequences. The aim of this thesis was to characterize the involvement of different capsid sequence domains in gene transfer. Therefore, AAV8 and AAV2 capsid mutants were generated which contained either large capsid domain exchanges between AAV2 and AAV8 or single amino acid residue swaps from AAV2 into the AAV8 capsid and vice versa. The exchange of large AAV2 domains into the AAV8 capsid showed that especially one domain which is involved in the capsid surface formation had also a strong impact on gene transduction of AAV8. The exchange of single amino acids in that domain induced for AAV8 as well as AAV2 particles a strong impact on gene transduction in vivo. In comparison to the wild type AAV8 capsid, capsid surface mutants could induce increased transduction efficiency as well as decreased transduction efficiency. One substitution which was located within the capsid shell caused a complete loss of gene transduction for AAV8 vectors, whereas another substitution situated at the inner shoulder of the spike region reconstituted heparin binding and strongly increased transduction efficiency of AAV8. Suprisingly, one reverse substitution of AAV2 amino acids exchanged with AAV8 amino acids which was also present on the inner shoulder of the spike region, could also increase gene transduction of AAV2 capsids, even close to the level of AAV8 gene transduction in some cases. Having determined domains which influence gene transduction of AAV8, a random peptide insertion site was inserted into the AAV8 capsid at the inner shoulder of the 3-fold spike region to test whether the capsid could change its targeting profile due to peptide insertions. Known peptide sequences which had been described to retarget AAV2 vectors could also induce targeting displayed on the AAV8 capsid. At that insertion site, an AAV8 random peptide display library was also inserted and used to select for hepatotropic vectors. Peptide motifs were recovered which reduced undesired gene transfer of rAAV8 vectors to other organs than liver tissue. Monoclonal antibody studies against the AAV8 capsid showed that binding occurs at the same site of the AAV8 capsid in which peptides had been inserted and amino acids had been exchanged to AAV2 amino acids and induced increased transduction efficiency. Antibody binding to the capsid could neutralize the infection, but did not inhibit viral uptake of the cell. The mechanism of neutralisation could not be enlightened completely.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kleinschmidt, Prof. Dr. Jürgen A.
Date of thesis defense: 18. June 2010
Date Deposited: 30. Jul 2010 11:46
Date: 2010
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: AAV8 , Gentherapie , Random Peptide Display library
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