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The Small Heat Shock Protein Hsp42 Controls the Spatio-Temporal Organization of Aggregated Proteins in Saccharomyces Cerevisiae

Specht, Sebastian

German Title: Das kleine Hitzeschockprotein Hsp42 kontrolliert die räumlich-zeitliche Organisation von aggregierten Proteinen in Saccharomyces cerevisiae

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Abstract

Stress-induced protein aggregation represents a major threat for cell survival and is also associated with various human disorders and cellular aging. The primary cellular response to aberrant protein conformations is the refolding of misfolded proteins by molecular chaperones or their elimination by AAA+ proteases. Once this first line of defense has been overrun, aggregated proteins are directed to specific compartments, thus protecting the cellular environment from potentially deleterious protein conformations. Organizing protein aggregates might also facilitate the recruitment of protein quality control components, thereby increasing the efficiency of aggregate removal in a subsequent phase. In Saccharomyces cerevisiae application of mild stress (37°C) results, upon inhibiting proteasomal degradation, in partitioning of misfolded proteins between two distinct compartments (Kaganovich, 2008). More mobile misfolded proteins, which are ubiquitylated and likely represent substrates for proteasomal degradation, are sequestered at the JUNQ (juxtanuclear quality control) compartment. Terminally aggregated, insoluble proteins are sorted to the peripheral IPOD (insoluble protein deposit) compartment that also harbors amyloidogenic proteins. To gain further insight into the spatio-temporal organization of misfolded proteins in Saccharomyces cerevisiae, I analyzed the localization of stress-induced protein aggregates by employing various fluorescent reporter proteins that either misfold upon stress application or bind to aggregated proteins. Since little is known about cellular factors involved in the sorting of misfolded proteins, I performed a candidate approach and focused on the Saccharomyces cerevisiae small heat shock proteins (sHsps), namely Hsp26 and Hsp42. I identified Hsp42 as an essential factor in the formation of IPOD-like inclusions. In hsp42 cells misfolded proteins do not accumulate in peripheral inclusions, but seem to be re-directed to the JUNQ. As Hsp42 localizes specifically to IPOD-like inclusions, but is absent from the JUNQ compartment, the lack of peripheral aggregation foci is a direct effect of missing Hsp42, thus illuminating a novel function of sHsps in controlling the cellular sorting of damaged proteins. In contrast, the second Saccharomyces cerevisiae sHsp, Hsp26, does not affect aggregate sorting and is present in both JUNQ and IPOD-like compartments. Transferring the elongated N-terminal domain (NTD) of Hsp42 to Hsp26 enables Hsp26 partially to replace Hsp42 function in aggregate sorting. In contrast, Hsp42 deleted of its NTD is not able to restore the occurrence of peripheral inclusions in hsp42Δ cells. The NTD is thus a key determinant in contributing functional specificity to Hsp42. My data suggest that Hsp42 acts as an adaptor protein that co-aggregates efficiently with misfolded proteins. The sHsp might link such complexes via its NTD to further, so far unknown, sorting factors. Thereby, protein inclusions might be directed to the actin cytoskeleton, which I demonstrate to be crucial for aggregate sorting to JUNQ and IPOD-like compartments. Nonetheless, Hsp42 function is restricted to amorphous aggregates, because the localization of amyloidogenic proteins to IPOD-like inclusions does not depend on Hsp42. Comparing the mobility and stability of aggregated proteins deposited at the JUNQ in wild-type and hsp42Δ cells revealed the JUNQ compartment of hsp42 cells to have a moderate increase in substrate mobility and be solubilized more rapidly by Hsp104. These findings suggest that the Hsp42-dependent sorting to IPOD-like compartments retards substrate resolubilization, thereby potentially reducing substrate load of the quality control system. I also analyzed the spatio-temporal organization of protein aggregates in cells with intact proteasomal degradation during sublethal heat-stress and a subsequent recovery phase allowing for aggregate solubilization. Heat shock generates multiple aggregation foci that are distributed throughout the cell. Sorting of aggregated proteins to JUNQ and IPOD-like deposition sites does not occur upon return to physiological growth conditions. Instead, protein disaggregation takes places in situ and does not require an intact actin cytoskeleton. My data thus demonstrate that the applied stress condition has a profound impact on the organization of misfolded proteins. Moreover, my findings disclose functional divergence of the Saccharomyces cerevisiae sHsps in the refolding and organization of heat shock-generated protein aggregates. Incorporation of Hsp26 facilitates the reactivation of aggregated proteins. In contrast, Hsp42 is not influencing protein refolding, but serves as a sorting factor essential for the persistence of protein inclusions in the cellular periphery.

Translation of abstract (German)

In Saccharomyces cerevisiae führt die Applikation von mildem Hitzestress, bei gleichzeitiger Inhibition von proteasomalem Proteinabbau, zur Ablagerung von missgefalteten Proteinen in zwei unterschiedlichen Kompartimenten, einem juxtanuklearen JUNQ (juxtanuclear quality control) und einem perivakuolären IPOD (insoluble protein deposit) Kompartiment (Kaganovich et al., 2008). Der JUNQ enthält mobilere missgefaltete Proteine, die ubiquityliert sind und wahrscheinlich Substrate für proteasomalen Abbau darstellen. Der IPOD hingegen scheint terminal aggregierte, unlösliche Proteine zu beherbergen, einschließlich amyloidogener Proteine. Um ein besseres Verständnis der räumlich-zeitlichen Organisation von missgefalteten Proteinen in Saccharomyces cerevisiae zu erlangen, habe ich die Lokalisation von stress-induzierten Proteinaggregaten verfolgt. Dafür habe ich von verschiedenen fluoreszenten Reportern Gebrauch gemacht, die entweder nach Stressapplikation selbst aggregieren oder an Proteinaggregate binden. Da wenig über zelluläre Faktoren bekannt ist, welche in der Ablagerung missgefalteter Proteine eine Rolle spielen, habe ich einen gerichteten Ansatz gewählt und mich auf die kleinen Hitzeschockproteine (sHsps) von Saccharomyces cerevisiae, Hsp26 und Hsp42, konzentriert. So habe ich Hsp42 als einen essentiellen Faktor für die Bildung IPOD-ähnlicher Strukturen identifiziert. In hsp42Δ Zellen akkumulieren missgefaltete Proteine nicht in peripheren Ablagerungen, sondern werden zum JUNQ dirigiert. Da Hsp42 ausschließlich in IPOD-ähnlichen Ablagerungen anzutreffen ist, nicht aber in JUNQ Kompartimenten, scheint das Fehlen peripherer Aggregatablagerungen in hsp42Δ Zellen eine direkte Konsequenz der Abwesenheit Hsp42s zu sein. Somit konnte eine neuartige Rolle der sHsps in der Aggregatablagerung aufgezeigt werden. Im Gegensatz dazu beeinflusst das zweite sHsp in Saccharomyces cerevisiae, Hsp26, die Aggregatablagerung nicht. Hsp26 ist sowohl im JUNQ als auch in IPOD-ähnlichen Kompartimenten anzutreffen. Transferiert man die elongierte N-terminale Domäne (NTD) von Hsp42 auf Hsp26, so kann Hsp26 teilweise die Hsp42 Funktion in der peripheren Aggregatablagerung übernehmen. Im Gegensatz dazu kann eine NTD-deletierte Hsp42 Mutante nicht die periphere Aggregatablagerung in hsp42Δ Zellen wiederherstellen. Somit ist eine Schlüsselrolle der NTD in der Funktion von Hsp42 aufgezeigt. Man kann spekulieren, dass Hsp42 als Adaptorprotein fungiert, welches mit Substraten effizient coaggregiert. Die daraus resultierenden Komplexe könnten durch die Hsp42 NTD an bisweilen nicht identifizierte Sortierfaktoren gekoppelt werden. Dadurch könnten Proteinaggregate an das Aktinzytoskelet gebunden werden, welches ich als essentielle Komponente für die Aggregatablagerung in JUNQ und IPOD-ähnlichen Kompartimenten identifiziert habe. Vergleicht man die Mobilität und Stabilität missgefalteter Proteine im JUNQ von wildtyp und hsp42Δ Zellen, so wird für hsp42Δ JUNQ Kompartimente eine moderate Erhöhung der Substratmobilität und schnellere Auflösung durch Hsp104 ersichtlich. Somit scheinen die Hsp42-abhängigen IPOD-ähnlichen Ablagerungen zu einer verlangsamten Solubilisierung von Substraten zu führen, was eine verringerte Substratmenge für die Proteinqualitätskontrollmaschinerie nach sich ziehen könnte. Hsp42 spielt jedoch nur eine Rolle in der Organisation amorpher Aggregate, da die Ablagerung von amyloidogenen Aggregaten in IPOD-ähnlichen Kompartimenten nicht von Hsp42 abhängt. Des Weiteren habe ich die räumlich-zeitliche Organisation von Proteinaggregaten während eines subletalen Hitzeschocks und anschließender Erholungsphase, welche Aggregatsolubilisierung erlaubt, in Zellen mit intaktem proteasomalem Proteinabbau untersucht. Der Hitzeschock generiert multiple Aggregate, welche in der gesamten Zelle verteilt sind. Die Ablagerung missgefalteter Proteine in JUNQ und IPOD-ähnlichen Kompartimenten ist nach der Rückkehr zu physiologischen Temperaturen nicht zu beobachten. Stattdessen findet die Proteindisaggregation in situ statt, wofür kein intaktes Aktinzytoskelet vonnöten ist. Folgerichtig wird das Schicksal missgefalteter Proteine von der Stressart bestimmt. Darüber hinaus habe ich eine funktionale Divergenz der Saccharomyces cerevisiae sHsps in der Rückfaltung und Organisation Hitzeschock-generierter Proteinaggregate entdeckt. Die Integration von Hsp26 beschleunigt die Reaktivierung aggregierter Proteine nach Hitzeschock. Im Gegensatz dazu beeinflusst Hsp42 die Proteinrückfaltung nicht, dient aber als Sortierungsfaktor, welcher für den fortdauernden Aufenthalt von Proteinaggregaten in der zellulären Peripherie zuständig ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bukau, Prof. Dr. Bernd
Date of thesis defense: 22. July 2010
Date Deposited: 02. Aug 2010 14:56
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Polypeptidketten bindende Proteine, Aggregat, Hitzestress, Saccharomyces cerevisiae
Uncontrolled Keywords: Molecular chaperones , protein aggregate , heat stress , Saccharomyces cerevisiae
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