German Title: Identifizierung und Charakterisierung der Protein Phosphatase 4 Regulatorische Untereinheit 1 (PP4R1) als Suppressor von NF-kappaB in T Lymphozyten und T Zell-Lymphomen

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Abstract

The transcription factor nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) plays a key role in the immune system by controlling lymphocyte survival and activation. Conversely, aberrant NF-kappaB activity has been implicated in several lymphoid malignancies and contributes to a variety of autoimmune disorders. While multiple kinases and phosphorylated target proteins that induce NF-kappaB activity have been identified, the molecular machinery involved in the termination of antigen receptor-mediated NF-kappaB activation is only partially understood. Since signal transduction from activated receptors to NF-kappaB largely relies on phosphorylation events, phosphatases are expected to play a major role in the modulation and termination of NF-kappaB activity. Therefore, the current study aimed at systematically defining phosphatases that are involved in T cell receptor (TCR)-induced NF-kappaB signaling. To this end, an RNA interference (RNAi) genetic screen has been adopted based on a novel NF-kappaB-dependent reporter system. Using this approach, several NF-kappaB-modulating phosphatases were identified among which the protein phosphatase 4 regulatory subunit 1 (PP4R1) was confirmed as a central negative regulator of NF-kappaB activity in T lymphocytes. PP4R1 expression is strongly upregulated in primary human T lymphocytes upon activation. PP4R1 specifically binds to the inhibitor of NF-kappaB kinase alpha (IKKalpha) and the catalytic subunit PP4c, thereby directing PP4c phosphatase activity to dephosphorylate and inactivate the IKK complex. Accordingly, PP4R1 silencing causes sustained and increased IKK activity and T cell hyperactivation as reflected by enhanced induction of NF-kappaB target genes and secretion of cytokines. Conversely, PP4R1 overexpression significantly impairs NF-kappaB activation upon TCR stimulation, but does not affect AP-1 signaling. Furthermore, PP4R1 was found to be downregulated in a subset of malignant T lymphocytes derived from patients with Sézary syndrome, a severe form of cutaneous T cell lymphoma (CTCL). PP4R1 deficiency causes constitutive IKK/NF-kappaB signaling and is required for survival of NF-kappaB-addicted CTCL cells. In summary, the present work identified PP4R1 as a central gatekeeper of IKK activity and as a suppressor of T cell activation and lymphoma survival. These findings expand our current knowledge of NF-kappaB signal transduction and contribute to a more precise molecular understanding of NF-kappaB regulation in health and disease.

Translation of abstract (German)

Der Transkriptionsfaktor nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) nimmt eine zentrale Stellung im Immunsystem ein. Physiologische NF-kappaB Aktivität ist essentiell für das Überleben und die Aktivierung von Lymphozyten. Hingegen ist aberrante NF-kappaB Signalgebung mit verschiedenen hämatologischen Neoplasien und Autoimmunerkrankungen assoziiert. Die T Zell-Rezeptor (TZR)-induzierte NF-kappaB Signalkaskade involviert eine Vielzahl von Kinasen und phosphorylierter Effektormoleküle. Im Gegensatz hierzu sind die molekularen Mechanismen, die der negativen Regulation des NF-kappaB Signalweges zugrunde liegen, nur zum Teil verstanden. Da Phosphorylierungsreaktionen ein zentrales Merkmal der Rezeptor-induzierten NF-kappaB Aktivierung darstellen, werden Phosphatasen als wichtige Modulatoren von NF-kappaB Aktivität vermutet. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Funktion einzelner Phosphatasen im TZR-induzierten NF-kappaB Signalweg systematisch zu adressieren. Hierfür wurde ein RNA Interferenz (RNAi) Screen durchgeführt auf Grundlage eines neu entwickelten NF-kappaB-spezifischen Reporter-Systems. Unter verschiedenen NF-kappaB-modulierenden Phospha-tasen wurde die protein phosphatase 4 regulatory subunit 1 (PP4R1) als ein zentraler negativer Regulator der NF-kappaB Aktivierung in T Lymphozyten identifiziert. Die PP4R1 Expression wird in aktivierten humanen T Lymphozyten stark induziert. PP4R1 fungiert als ein Adapter zwischen der inhibitor of NF-kappaB kinase alpha (IKKalpha) und der katalytischen PP4 Untereinheit PP4c und reguliert somit PP4 Phosphatase Aktivität zur spezifischen Dephosphorylierung und Inaktivierung des IKK Komplexes. Die RNAi-vermittelte Suppression der PP4R1 Expression verursacht eine erhöhte und prolongierte IKK Aktivität und eine verstärkte Induktion und Sekretion NF-kappaB-abhängiger Gene bzw. Zytokine. Umgekehrt führt die Überexpression von PP4R1 zu einer spezifischen Blockade des NF-kappaB Signalweges nach TZR Stimulation. In malignen T Lymphozyten von Patienten mit dem Sézary Syndrom, einer aggressiven und leukemischen Variante des Kutanen T Zell Lymphoms (engl.: cutaneous T cell lymphoma, CTCL) ist die PP4R1 Expression deutlich erniedrigt. Die Defizienz von PP4R1 resultiert in konstitutiver IKK/NF-kappaB Signalgebung und ist verantwortlich für das Überleben NF-kappaB-abhängiger CTCL-Zellen. In dieser Arbeit konnte PP4R1 als ein neuer zentraler Regulator des NF-kappaB Signalweges und als ein Suppressor von T Zell-Aktivierung und T Zell-Lymphomen identifiziert werden. Dies erweitert unser molekulares Verständnis des NF-kappaB Signalweges und seiner Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen.