German Title: Identifikation von DNA Methylierungsmustern und sich unterscheidenden microRNAs in Brustkrebs

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Abstract

Summary Deregulation of factors involved in the epigenetic regulation of gene expression is a hallmark of cancer. In this dissertation, DNA methylation and microRNA (miRNA) expression, as two components implicated in epigenetic regulation, were studied in breast cancer. In the first study, the establishment of a DNA methylation signature for breast cancer was aimed at, based on the early occurrence and stability of abnormal DNA methylation patterns in tumors. Specialized oligonucleotide microarrays were developed and optimized to screen DNA methylation patterns of the candidate loci associated with breast cancer. The assay was applied to analyze DNA methylation patterns of breast cancer and control samples. The profiling data was subjected to multiple bioinformatic analyses in order to identify a DNA methylation signature with appropriately high potential for diagnosis. Methylation patterns of CpG sites associated with two genes, SFRP2 and GHSR, were identified as promising markers. Up-regulation and activation of estrogen receptor α (ERα) signaling is a common feature of almost 70% of breast cancers. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying deregulation of this signaling pathway is scarce. In the second study, based on miRNA profiling data of human mammary cell lines, miR-375 was identified as an overexpressed miRNA in ERα-positive cells. Analysis of the miRNA locus revealed that miR-375 overexpression is mainly caused by the loss of epigenetic marks, such as H3K9me2 and local DNA hypomethylation, which, in turn, triggers the dissociation of the transcriptional repressor CCCTC-binding factor (CTCF) from the promoter and enables interactions of ERα with regulatory regions of miR-375. Inhibition of miR-375 in ERα-positive MCF7 cells resulted in reduced ERα activation and cell proliferation. In addition, RASD1, an estrogen inducible gene, was identified as a miR-375 target mediating miR-375 effect on ERα. These data indicate the existence of a positive feedback regulation between ERα and miR-375. The methylation signature identified shows a promising potential to be applicable for diagnosis/risk assessment of breast cancer. Furthermore, our findings from miRNA study provide significant insight into the deregulation of ERα pathway, which may open new therapeutic strategies for breast cancer.

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung Krebserkrankungen weisen meist eine veränderte epigenetische Regulation der Genexpression auf. In dieser Dissertation werden sowohl DNA-Methylierung als auch die Expression von microRNA (miRNA) als zwei Komponenten der epigenetischen Regulation in Brustkrebs untersucht. Veränderte DNA-Methylierungsmuster tauchen in Tumoren gewöhnlich früh auf und haben eine hohe Stabilität. Daher hatte die erste Studie das Ziel, eine für Brustkrebs spezifische Signatur der DNA-Methylierung zu identifizieren. Hierzu wurden spezifische Oligonukleotidarrays entwickelt und optimiert, um DNA-Methylierungsmuster ausgewählter Kandidaten-Loci zu untersuchen, die mit Brustkrebs assoziert werden. Um derartige Muster mit einem ausreichend hohen Potential für eine Diagnose auszuwählen, wurden Tumorproben mit gesunden Kontrollen verglichen und einer Vielzahl von bioinformatischen Analysen unterzogen. Hierbei wurden Methylierungsprofile in zwei CpG-Bereichen identifiziert, die mit den Genen SFRP2 und GHSR assoziiert sind und ein Potenzial für eine Diagnosestellung besitzen. Eine erhöhte Expression und Aktivierung der Estrogenrezeptor α (ERα)-Signalkaskade ist ein gemeinsames Merkmal von fast 70% aller Tumore der Brust. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser Signalkaskade sind bislang wenig verstanden. Daher wurden in einer zweiten Studie humane Mammakarzinomzelllinien mittels eines miRNA-Profilings untersucht. Hierbei wurde eine deutliche Überexpression von miR-375 in Erα-positiven Zellen entdeckt. Eine Analyse des miRNA-Lokus zeigte, dass die Überexpression hauptsächlich durch den Verlust von epigenetischen Markierungen, wie beispielsweise H3K9me2, sowie eine lokale DNA-Hypomethylierung verursacht werden. Die Hypomethylierung löst eine Dissoziation des Transkriptionsrepressors CTCF vom Promotor aus und ermöglicht Interaktionen von Erα mit den regulatorischen Regionen von miR-375. Eine Inhibierung von miR-375 in ERα-positiven MCF7 Zellen resultierte in einer reduzierten ERα-Aktivierung und Zellproliferation. Zusätzlich wurde festgestellt, dass das estrogeninduzierbare Gen RASD1 als ein Ziel-Gen von miR-375 den Effekt auf Erα vermittelt. Diese Daten dokumentieren eine vorhandene positive Rückkopplung zwischen ERα und miR-375. Das in dieser Arbeit identifizierte spezifische Methylierungs-Muster zeigt ein vielversprechendes Potenzial für die Anwendung im Rahmen von Brustkrebs-Diagnose und –Prognose. Die Ergebnisse der miRNA-Studie ermöglichen neue Einblicke in die Regulation der ERα-Signalkaskade und könnten neue Möglichkeiten in der Entwicklung theapeutischer Strategien zur Brustkrebsbehandlung eröffnen.