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Hypoxic regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in HPV-positive non-tumorigenic and tumorigenic cells

Hitschler, Anna

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Abstract

Metabolic adaptations of cancer to scarce oxygen conditions are believed to contribute to the tumor promoting effect of hypoxia. To assess this issue in the context of human papillomavirus induced cervical carcinogenesis, the hypoxic regulation of the glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was investigated in non-tumorigenic HPV-positive HeLa x fibroblast hybrid cells (444), their tumorigenic segregants CGL 3 and the parental homologues IMR 90 and HeLa. 24 hours hypoxia lead to a transcriptional upregulation of GAPDH only in non-tumorigenic cells but not in their tumorigenic counterparts. As shown by ChIP analysis, the hypoxic increase of GAPDH was mediated by the transcription factors Net and HIF-2α. Their binding to the GAPDH promoter was augmented upon hypoxia exclusively in non-tumorigenic cells. Moreover, GAPDH-reporter assays revealed a synergistic trans-activating effect of Net and HIF-2α only in non-tumorigenic cells which was further enhanced by hypoxia. Intriguingly, GAPDH acts as a trigger between cell death and survival. To investigate whether the differential hypoxic regulation of GAPDH in non-tumorigenic and tumorigenic cells reflects their resistance to hypoxic conditions, cell viability was monitored by determining the cellular ATP content and by FACS analysis. Indeed, the hypoxic increase of GAPDH correlated with a better cell viability in non-tumorigenic 444 cells. Moreover, FACS assays revealed different responses to hypoxia in tumorigenic CGL 3 and HeLa cell. While HeLa substantially increased apoptosis upon hypoxia, CGL 3 underwent a different type of cell death, possibly necrosis. Apoptosis in HeLa was likely caused by an altered ROS homeostasis, as this cell line did not show the expected hypoxic increase of oxygen radicals. In contrast, CGL 3 probably died of irreversible energy depletion, as they depicted the lowest ATP levels of all tested cell lines upon hypoxia. Another factor which might influence hypoxic survival are the viral oncoproteins E6 and E7. This study determined complete silencing of their expression upon hypoxia in both tumorigenic and non-tumorigenic cell lines. The main regulator of HPV transcription, the cellular transcription factor AP-1, was not responsible for this effect, as neither its dimeric composition nor the expression of its cognate subunits changed upon hypoxic treatment. Taken together, this study indicates a dysregulation of hypoxic GAPDH expression in cervical cancer cells which may influence survival of energy stress upon hypoxia. Whether the silencing of the HPV oncoproteins upon hypoxia contributes to this observation requires further investigation.

Translation of abstract (German)

Hypoxie induziert metabolische Anpassungsprozesse in Krebszellen, die das Tumorwachstum fördern. Um diesen Zusammenhang am Model der HPV-induzierten zervikalen Karzinogenese zu erforschen, wurde die hypoxische Regulation des glykolytischen Enzyms Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) in den nicht-tumorigenen HPV-positiven HeLa X Fibroblast Zellhybriden 444, in deren tumorigenen Abkömmlingen CGL 3 und in den parentalen Zellinien IMR 90 und HeLa untersucht. Es stellte sich heraus, dass der hypoxische Anstieg der GAPDH Expression ausschließlich in nicht-tumorigenen Zellen zu beobachten ist. Er wird von den Transkriptionsfaktoren Net und HIF-2α vermittelt, die unter Hypoxie nur in nicht-tumorigenen Zellen vermehrt an den GAPDH Promoter binden. Darüberhinaus zeigten GAPDH-Reporter Assays eine synergistische Aktivierung der GAPDH Transkription durch Net und HIF-2α, die unter Hypoxie weiter verstärkt wird und ebenfalls auf nicht-tumorigene Zellen beschränkt ist. Um zu zeigen, dass die unterschiedliche GAPDH Regulation unter hypoxischen Bedingungen auf eine Diskrepanz der hypoxischen Resistenz in tumorigenen und nicht-tumorigenen Zellen hindeutet, wurde eine FACS Analyse und eine Untersuchung des zellulären ATP Gehalts durchgeführt. Die hypoxische Induktion der GAPDH Expression in IMR 90 und 444 korreliert tatsächlich mit einer besseren Lebensfähigkeit dieser Zellen unter diesen Bedingungen. Darüberhinaus enthüllte die FACS Analyse eine unterschiedliche hypoxische Reaktion der beiden tumorigenen Zelllinien. Während Hypoxie in HeLa vor allem Apoptose induziert, durchlaufen CGL 3 eine andere Form des Zelltods, bei dem es sich um Nekrose handeln könnte. Die Apoptose in HeLa wird wahrscheinlich durch eine vermehrte Empfindlichkeit auf Sauerstoffradikale hervorgerufen, da HeLa nicht die erwartete hypoxische Zunahme der Sauerstoffradikale zeigt. Im Gegensatz dazu sterben CGL 3 vermutlich an irreversibler Energiedefizienz, da sie unter Hypoxie die niedrigsten ATP Werte aller getesteten Zellen aufweisen. Weitere Faktoren, die das hypoxische Überleben der Zelle beeinflussen könnten, sind die viralen Onkoproteine E6 und E7. Diese Studie konnte ihre Hypoxie-vermittelte Suppression nachweisen und darüber hinaus zeigen, dass dies nicht durch den zellulären Transkriptionsfaktor AP-1 verursacht wird. Weder die Komposition des dimeren Faktors AP-1 noch die Expression seiner Untereinheiten ändert sich unter Hypoxie. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Krebszellen eine Dysregulation der hypoxischen GAPDH Transkription aufweisen die das zelluläre Überleben unter hypoxischem Energiestress beeinflussen könnte. In wieweit sich die Stilllegung der viralen E6 und E7 Gene auf diese Beobachtung auswirkt, bedarf weiterer Forschung.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Zawatzky, Prof. Dr. Rainer
Date of thesis defense: 21 October 2010
Date Deposited: 25 Oct 2010 10:36
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Hypoxie , HPV , GAPDHhypoxia , HPV , GAPDH
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