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Pharmakokinetische Untersuchungen genkorrigierter Hämatopoese in klinischen retroviralen Studien

Paruzynski, Anna

English Title: Pharmacokinetic analyses of gene-corrected hematopoiesis in clinical retroviral studies

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PDF, German (Dissertation Anna Paruzynski)
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Abstract

Die somatische Gentherapie mit retroviralen Vektoren konnte erfolgreich zur Behandlung monogenetischer Erbkrankheiten eingesetzt werden. Jedoch traten bereits in 3 klinischen Gentherapiestudien schwerwiegende vektorinduzierte Nebenwirkungen auf. Integrationsstellen (IS)-Analysen erlaubten die Detektion von Integrationen in oder in der Nähe von Protoonkogenen, die zu einer Überexpression der Gene und zur malignen Entartung der betroffenen Zellen führten, an deren Folgen 2 der 7 erkrankten Patienten verstarben. Umfassende Analysen der Vektor-IS und deren Einfluss auf zelluläre biologische Prozesse sind daher von größter Wichtigkeit und können dabei helfen, mögliche Risiken schon frühzeitig auf der molekularen Ebene zu erkennen. Die Bestimmung der IS erfolgte in den untersuchten klinischen Gentherapiestudien mithilfe der linearen amplifikationsmediierten PCR (LAM-PCR). Zur Verbesserung des zugänglichen Anteils der IS wurde ein mathematisches Modell entwickelt, das die genomische Zugänglichkeit von IS in Abhängigkeit der verwendeten Restriktionsenzyme a priori berechnet. Weiterer Bestandteil meiner Arbeit war die Etablierung einer nicht restriktiven (nr) LAM-PCR, die eine IS-Analyse ohne die Verwendung von Restriktionsenzymen ermöglicht. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende IS-Analyse in Kombination mit der Sanger Sequenzierung von 5 klinischen (2547 IS) und 3 präklinischen (1316 IS) gammaretroviralen Studien zeigte beeindruckende Übereinstimmungen. So wurden über 70% aller IS in genkodierenden Bereichen detektiert mit einer Anhäufung um die Transkriptionsstartstelle (TSS, 23%-39%). Weiterhin konnten wir die Protoonkogene MDS1-EVI1 (108 IS), PRDM16 (37 IS), LMO2 (13 IS), CCND2 (12 IS) und SETBP1 (10 IS) als gemeinsame bevorzugte Integrationsorte beobachten. Ein weiterer Fokus stellten die Klonalitäts- und pharmakokinetischen Analysen der Proben von insgesamt 9 Patienten aus zwei X-CGD, einer ADA-SCID und einer WAS gammaretroviralen Gentherapiestudie dar, die über einen Zeitraum von bis zu 5 Jahren nach Therapie erfolgten. In allen untersuchten Studien zeigte die (nr) LAM-PCR Analyse gefolgt von der Pyrosequenzierung (GS FLX, > 20000 IS) ebenfalls eine nicht zufällige Verteilung mit einer bevorzugten Integration in genkodierenden Bereichen (47%-72%) und einer Anhäufung der IS um die TSS (8%-16%). Weiterhin wurden ebenfalls bevorzugte Integrationsorte in oder in der Nähe der Protoonkogene MDS1-EVI1 (289 IS), PRDM16 (104 IS), LMO2 (52 IS), SETBP1 (34 IS) und CCND2 (33 IS) detektiert. Mittels LAM-PCR „Sequence Count“ Analysen konnte eine vektorinduzierte in vivo Selektion einzelner MDS1-Klone in 3 der insgesamt 4 X-CGD Patienten beobachtet werden. Reverse Transkriptase (RT)-PCR Untersuchungen zur Genexpression in einem X-CGD Patienten zeigten eine Überexpression der von der Integration betroffenen Gene MDS1-EVI1 und STAT3. In den weiteren Patienten der untersuchten Gentherapiestudien verlief die hämatopoetische Repopulation bis zum letzten analysierten Zeitpunkt polyklonal. Allerdings konnten wir auch in der WAS Gentherapiestudie eine in vivo Selektion eines CCND2- und eines MDS1-Klons über „Sequence Count“ Analyse und qPCR nachweisen. Die Klonalitätsanalysen mittels LAM-PCR/nrLAM-PCR und Hochdurchsatzsequenzierung (Pyrosequenzierung, GS FLX) führten zu einer einzigartigen Datensammlung von insgesamt > 20000 IS aus klinischem Patientenmaterial. Unsere Untersuchungen zeigten, dass herkömmliche retrovirale Vektoren mit aktivem LTR einen sehr signifikanten Einfluss auf die zelluläre Genexpression ausüben. Es bleibt längerfristigen Untersuchungen vorbehalten, zu klären, welche biologischen Auswirkungen die retro- und lentiviralen Vektorsysteme mit selbstinaktivierendem (SIN) LTR auf das Schicksal der transduzierten Zelle haben.

Translation of abstract (English)

Somatic gene therapy using retroviral vectors could be used successfully for the treatment of monogenetic inherited diseases. However, with increased efficiency vector-induced severe side effects have already been reported in 3 clinical gene therapy trials. There, integration site (IS) analyses allowed the precise identification and sequencing of the IS locus in the affected cells. In all reported severe adverse events the integrants were found in or close to proto-oncogenes that led to an overexpression of these genes and to malignant cell transformation. Finally 2 of the 7 diseased patients died of the consequences. Thus, comprehensive analyses of the vector integrations and their effects on cellular biological processes are of prime importance and can help to assess the potential risk at an early stage on the molecular level. In this thesis, IS identification was carried out by using the linear amplification mediated PCR (LAM-PCR) method. To determine the genomic access to viral IS in the host genome, a mathematical model was developed, that enabled the calculation of the genomic accessibility to viral IS a priori in dependence of the used restriction enzymes. Moreover, we could develop a non-restrictive (nr) LAM-PCR without the restrictive application of restricition enzymes conventionally needed in IS analyses. Our comparative IS analysis combined with sanger sequencing was carried out in the scope of this thesis with 5 clinical (2547 IS) and 3 preclinical (1316 IS) gammaretroviral studies, showing impressive correlations between the studies. Thus, more than 70% of the integrations were found to be located in gene coding regions with an accumulation around the transcription start site (TSS, 23%-39%). Furthermore, we found the proto-oncogenes MDS1-EVI1 (108 IS), PRDM16 (37 IS), LMO2 (13 IS), CCND2 (12 IS) and SETBP1 (10 IS) as most common favored integration loci. A further focus presented the clonality and pharmacokinetic analyses of samples from 9 patients from two X-CGD, one ADA-SCID and one WAS gammaretroviral clinical gene therapy study over a period of 5 years after therapy. For all analyzed studies, (nr) LAM-PCR followed by pyrosequencing (GS FLX, > 20000 IS) also observed a non-random IS distribution with favored integrations in gene coding regions (47%-72%) and an accumulation around the TSS (8%-16%). The results further also revealed the detection of favored integrations in or close to the proto-oncogenes MDS1-EVI1 (289 IS), PRDM16 (104 IS), LMO2 (52 IS), SETBP1 (34 IS) and CCND2 (33 IS). Using LAM-PCR „Sequence Count” analyses a vector-induced in vivo selection of individual MDS1 clones was observed in 3 out of 4 treated X-CGD patients. Reverse Transcriptase (RT)-PCR analyses of the gene expression in one X-CGD patient showed an overexpression of the affected genes MDS1-EVI1 and STAT3. For all further patients of the analyzed clinical gene therapy studies the hematopoietic repopulation stayed polyclonal until the latest time point analyzed. However, for the WAS gene therapy trial we could also detect an in vivo selection of one CCND2 and one MDS1 clone by „Sequence Count” analysis and qPCR. The clonality analyses using LAM-PCR/nrLAM-PCR in combination with next generation sequencing (pyrosequencing, GS FLX) led to the generation of a unique data collection of > 20000 total IS from clinical patient material. Our analyses revealed that conventional retroviral vectors with an active LTR have a really significant influence on the cellular gene expression. Long-term studies will help to clarify the biological consequences of the retro- and lentiviral selfinactivating (SIN) LTR vector systems on the fate of the transduced cell.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bosch, Prof. Dr. Valerie
Date of thesis defense: 4. May 2010
Date Deposited: 02. Nov 2010 13:00
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Gentherapie
Uncontrolled Keywords: Immunerkrankungenimmunodeficiencies
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