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Regulation of MHC class I polypeptide related sequence B expression in melanoma cells under proteasome inhibition

Vokhminova, Daria

German Title: Die Regulation von MICB Expression in Melanomzellen unter Proteasominhibition

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Abstract

Malignant melanoma is a very aggressive tumor with a high metastatic potential and persistently increasing incidence rate. The low efficacy of conventional chemotherapy and radiation demands for the development of new approaches. Several new strategies take advantage of the strong intrinsic immunogenicity of the tumor that in principle allows autologous Natural killer (NK) cells and T cells to recognize and kill melanoma cells. One of the key receptors involved in the anti-tumor immunity is NKG2D, expressed on NK cells and CD8+ T cells. So far, eight surface ligands for this receptor have been identified in humans, belonging to the MIC and ULBP molecule families. Interaction of NKG2D with its surface ligands activates and costimulates the cytotoxic activity of NK cells and T cells, respectively. Expression of NKG2D ligands (NKG2DL) is known to be induced upon cell stress and moderate expression of NKG2DL can also be observed on tumor cells. Thus developing strategies that induce NKG2DL expression on tumor cells might be helpful to enhance anti-tumor immune responses, but as a prerequisite the mechanisms of NKG2DL regulation have to be elucidated. Proteasome inhibition causes so-called proteotoxic stress by an accumulation of unfolded proteins in the cell. As proteasome inhibitors are currently tested in melanoma therapy, the aim of the present study was to identify the impact of proteasome inhibition on NKG2DL expression in human melanoma cells. It was observed that treatment with the proteasome inhibitor MG132 strongly up-regulated the surface expression of the NKG2DL MICB on melanoma cells. Inhibitor treated cells contained elevated levels of MICB mRNA. MICB promoter driven luciferase reporter gene assays demonstrated that this up-regulation was dependent on transcription. Mutation of a heat shock factor 1 (HSF1) binding site within the MICB promoter region abrogated induction of transcription by MG132. Indeed, an enhanced binding of HSF1 to the MICB promoter in MG132 treated cells was demonstrated by chromatin immunoprecipitation (ChIP). Moreover, transfection of melanoma cells with a constitutively active HSF1 variant strongly stimulated MICB promoter driven reporter gene expression, whereas siRNA-mediated down-regulation of HSF1 blocked MICB induction upon proteasome inhibition. Interestingly, while over-expression of constitutive active HSF1 in the melanoma cells stimulated MICB promoter driven reporter gene expression, it did not enhance the transcription of endogenous MICB in melanoma cells, suggesting that under “normal conditions” HSF1 could not efficiently access the MICB promoter. Ubiquitination of histone H2A is known as an epigenetic mechanism of gene silencing. ChIP experiments demonstrated that ubiquitinated histone H2A is associated with the MICB promoter and that treatment of melanoma cells with MG132 resulted in a loss of H2A ubiquitination. This leads to the conclusion that proteasome inhibition elicits MICB expression by two events: down-regulation of the ubiquitination level of H2A, which controls promoter accessibility, and activation of HSF1 which then binds the MICB promoter and induces its transcription.

Translation of abstract (German)

Das maligne Melanom ist ein sehr aggressiver Tumor mit hohem Potential zur Metastasierung und stetig steigender Inzidenz. Die geringe Effizienz konventioneller Chemo- und Strahlentherapien verlangt nach der Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien. Verschiedene neue Ansätze machen sich die hohe intrinsiche Immunogenität des Tumors zu Nutze, die es autologen Natürlichen Killer (NK) Zellen und T Zellen in Prinzip erlaubt, Melanomzellen zu erkennen und zu töten. Ein “Schüssel”-Rezeptor in der anti-Tumor Immunität ist NKG2D, der auf NK Zellen und CD8+ T Zellen exprimiert wird. Bislang wurden acht Oberflächenliganden dieses Rezeptors im Menschen identifiziert, die zur Familie der MIC oder ULBP Familie gehören. Die Interaktion von NKG2D mit seinen Oberflächenliganden aktiviert bzw. kostimuliert die zytotoxische Aktivität von NK Zellen und T Zellen. Die Expression von NKG2D Liganden (NKG2DL) wird bekanntermaßen durch Zellstress induziert und eine moderate NKG2DL Expression kann auch auf Tumorzellen beobachtet werden. Folglich könnten Strategien, welche die Expression der Liganden auf Tumorzellen induzieren, hilfreich sein, um anti-Tumor Immunantworten zu verstärken. Als Voraussetzung hierfür müssen jedoch die Mechanismen der NKG2DL Regulation aufgeklärt werden. Die Inhibition des Proteasoms verursacht durch die Akkumulation von ungefalteten Proteinen sogenannten proteotoxischen Stress in der Zelle. Da Proteasominhibitoren derzeit in der Melanomtherapie getestet werden, war das Ziel der vorliegenden Arbeit den Einfluss der Proteasominhibition auf die NKG2DL Expression in humanen Melanomzellen zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass die Behandlung mit dem Proteasominhibitor MG132 zu einer starken Hochregulation der Oberflächenexpression des Liganden MICB auf Melanomzellen führte. Inhibitor behandelte Zellen enthielten erhöhte Mengen an MICB mRNA. MICB promoter-getriebene Luziferase-Reportergen Analysen ergaben, dass die Hochregulation in Abhängigkeit von der Transkription erfolgte. Durch die Mutation einer Hitzeschock Faktor 1 (HSF1) Bindungsstelle in der MICB Promoterregion wurde die Induktion der Transkription durch MG132 aufgehoben. Tatsächlich konnte eine verstärkte Bindung von HSF1 an den MICB Promoter in MG132 behandelten Zellen mittels Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) nachgewiesen werden. Zudem führte die Transfektion von Melanomzellen mit einer konstitutiv aktiven HSF1 Variante zur einer starken Stimulierung der MICB Promoter-getriebenen Reportergen Expression, wohingegen durch die siRNA-vermittelte Herabregulation von HSF1 die MICB Induktion unter Inhibition des Proteasoms aufgehoben wurde. Während die Überexpression von konstitutiv aktivem HSF1 in Melanomzellen die ICB Promoter-getriebene Reportergen Expression stimuliert, konnte keine verstärkte Transkription von endogenem MICB in Melanomzellen beobachtet werden. Dies führte zu der Annahme, dass unter “normalen Bedingungen” ein effizienter Zugang von HSF1 zum MICB Promoter nicht möglich ist. Die Ubiquitinierung von Histon H2A ist bekannt als ein epigenetischer Mechanismus, der Gene abschaltet. ChIP Experimente zeigten, dass ubiquitiniertes Histon H2A mit dem MICB Promotor assoziiert ist und dass die Behandlung von Melanomzellen mit MG132 zu einem Verlust der H2A Ubiquitinierung führte. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass die Inhibition des Proteasoms die Expression von MICB über zwei Ereignisse steuert: die Herabregulation des Ubiquitinierung von H2A, welche den Zugang zum Promoter kontrolliert, und die Aktivierung von HSF1, welches dann an den MICB Promotor bindet und die Transkription induziert.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Umansky, Prof. Dr. Viktor
Date of thesis defense: 10. November 2010
Date Deposited: 11. Nov 2010 13:19
Date: 2010
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: NKG2D , MICB , proteasome inhibition
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